赵维莅教授团队开发的DLBCL基因分型简化算法（LymphPlex）

研究在瑞金医院1001例新诊断的 DLBCL 患者中开展，根据世界卫生组织 (WHO) 分类确立组织学诊断。分别对228例和109例可获得肿瘤标本的患者进行 WES 和WGS，其余664例分析了覆盖35个淋巴瘤相关基因（ARID1A、B2M、BTG1、BTG2、CCND3、CD70、CD79B、CIITA、CREBBP、DDX3X、DTX1、DUSP2、EP300、EZH2、FAS、GNA13、IRF4、IRF8、KMT2D、MPEG1、MYD88、NOTCH1、NOTCH2、PIM1、PRDM1、SGK1、SOCS1、STAT3、STAT6、TBL1XR1、TET2、TNFAIP3、TNFRSF14、TP53、和ZFP36L1）以及BCL2、BCL6和 MYC 重排的靶向测序数据。可用于 RNA-seq 的患者共475例，其中 WES/WGS 组207例，靶向测序组268例。

简化LymphPlex算法是一种新的聚类策略，它基于 LymphGen 算法，但以简化的方式设计，基于35个基因突变和3个基因（BCL2、BCL6和MYC）重排进行分类。

为评估LymphPlex，作者还纳入了两个验证队列：BCC队列包括320例接受 R-CHOP 治疗的新诊断 DLBCL 患者，具有来自靶向基因测序组和 FISH 结果的可用临床和基因组数据；HMRN队列，包括来自现实世界研究的928例 DLBCL 患者（617例患者接受R-CHOP），有可用的临床和基于小组的 DNA 测序数据。

为DLBCL基因亚型分型建立的简化LymphPlex算法

在1001例患者的瑞金队列中，543例 (54.2%) 为男性，424例 (42.4%) > 60岁，104例 (10.4%) 体能状态较差，467例 (46.7%) 血清乳酸脱氢酶 (LDH) 升高，457例 (45.7%) Ann Arbor晚期，266例 (26.6%) 有多个结外受累。根据国际预后指数 (IPI) 的定义，516例 (51.5%) 为低危，485例 (48.5%) 为中危或高危。243例 (25.6%) 为 BCL2/MYC 双表达淋巴瘤。COO 分型：GCB-DLBCL 148例 (31.2%) ,ABC-DLBCL 235例 (49.5%) ,无法分类亚型92例 (19.4%)。与训练队列相比，验证队列老年患者率增加，体能状态较差，中高危或高危 IPI 和 GCB-DLBCL 患者也增加。

作者首先在具有 WES 或 WGS 数据 (n = 337) 的训练队列中应用基于 LymphGen 算法确定遗传亚型分类，确定了以下7种基因亚型：TP53Mut（TP53突变）、MCD样（MYD88、CD79B、PIM1、MPEG1、BTG1、TBL1XR1、PRDM1、IRF4突变）、BN2样（BCL6融合、NOTCH2、CD70、DTX1、BTG2、TNFAIP3、CCND3突变）、N1样（NOTCH1突变）、EZB样（BCL2融合、EZH2、TNFRSF14、KMT2D、B2M、FAS、CREBBP、ARID1A、EP300、CIITA、STAT6、GNA13突变，伴或不伴 MYC 重排）和 ST2 样（SGK1、TET2、SOCS1、DDX3X、ZFP36L1、DUSP2、STAT3、IRF8突变）（图1）。

337例有 WES/WGS 数据的患者中，171例患者 (50.7%) 可归类为不同基因亚型，其余166例患者 (49.3%) 归类为非特指型 (NOS)。在171例分类病例中，44例 (25.7%) 为TP53Mut，37例 (21.6%) 为 MCD 样，39例 (22.8%) 为 BN2 样，12例 (7.0%) 为 N1 样，19例 (11.1%) 为 EZB 样，20例 (11.7%) 为 ST2 样。在 EZB 样亚型中，3例 (15.8%) 有 MYC 融合。根据既往GenClass 算法的20个基因算法可确定5种基因亚型：TP53Mut（TP53 突变）；MCD样（MYD88、CD79B、PIM1、MPEG1、BTG1和 TBL1XR1 突变）；BN2样（FBCL6 和NOTCH2、TNFAIP3、CD70和 DTX1 突变）；N1样（NOTCH1 突变）和 EZB 样（FBCL2 和EZH2、TNFRSF14、CREBBP、EP300、MTOR和 STAT6 突变）。新开发的 LymphPlex 原理上与GenClass 算法一致。

评估LymphGen算法

作者对瑞金队列中337例具有 WES/WGS 数据的患者应用了 LymphPlex 和 LymphGen 算法。所有 WES/WGS 突变和拷贝数变异体均用作 LymphGen 的输入，利用 LymphGen 结果作为性能基准。

LymphPlex 算法在50.7% (171/337) 的病例中分配了基因亚型，而 LymphGen 算法在35.6% (120/337) 的病例中分配了基因亚型 (图2a)。106例被两种算法归为独特的基因亚型 (图2b)。排除 LymphPlex 的 TP53Mut 病例和 LymphGen 的 A53 病例后，计算了 LymphPlex 算法对其余87例亚型分配的敏感性、特异性和精确度（阳性预测值）（图2c）。LymphPlex 算法性能可接受，灵敏度均在94%以上，特异性均在99%以上，精密度均在90%以上 (图2d)。LymphPlex 亚型一般属于相应的 LymphGen 亚型。

DLBCL各基因亚型的遗传和表型属性

为评估LymphPlex 算法的可重复性，作者分析了瑞金队列 (n=1001)、BCC队列 (n=320) 和 HMRN 队列 (n=928) 中 LymphPlex 分配亚型的遗传和表型特征，三个队列中 LymphPlex 分配的各亚型分布相当。与 BCC 队列和 HMRN 队列相比，瑞金队列BN2 样和 N1 样亚型的发生率增加，但 EZB 样亚型的发生率降低（图3a）；值得注意的是，在低危 (IPI 0-1) 和中高危 (IPI 2-5) 患者中均有相似的基因亚型分布模式 (图3b)，表明基因亚型发生率的差异并非由3个队列中 IPI 风险人群分布不均匀所导致。此外，老年患者中MCD样亚型有所增加，而 N1样亚型数量减少；血清 LDH 升高患者中TP53Mut 和 MCD样亚型增加，而 ST2 样降低；多个结外受累患者中MCD样亚型增加，而 ST2样亚型降低。因此中/高危或高危 IPI 患者在 SCD 样亚型中同样增加，而在 ST2 样亚型中减少。

COO 分类方面，大多数 MCD 样亚型患者为ABC-DLBCL，而大多数 EZB 样患者为GCB-DLBCL（图3c），这与中国患者中 GCB-DLBCL 发生率相对较低一致。MCD 样亚型中BCL2/MYC 双表达率较高 (图3d)。各基因亚型内COO 和 BCL2/MYC 双表达的组成， 3个队列相当(图3c，d)，基因突变和 BCL2/BCL6 重排也是如此 (图3e)。

DLBCL各基因亚型的预后价值

作者评估了每个队列中 LymphPlex基因亚型对预后的影响，对接受 R-CHOP 治疗的患者进行生存分析。与 BN2 样、EZB样和 ST2 样亚型相比，TP53Mut和 MCD 样亚型的PFS相对较差（图4a）；在 GCB-DLBCL 中，ST2样亚型相对较优；在 ABC-DLBCL 中，BN2样亚型相对较优。鉴于一致的生存趋势，作者整合了所有三个队列的数据以估计合并的风险比 (图4b)。在该模型中，TP53Mut亚型的 PFS 劣于 TP53WT 患者 (P<0.0001)；MCD样亚型的 PFS 劣于所有非 MCD样亚型 (P=0.0038)；GCB-DLBCL内 ST2样亚型的 PFS 优于所有非 ST2样亚型 (P=0.0005)；ABC-DLBCL 内 BN2 样亚型的 PFS 优于所有非 BN2 样亚型 (P=0.0233)。在瑞金队列中根据 MYC 重排对 EZB 样亚型进行了细分：MYC+病例的 PFS 明显劣于 MYC-病例 (P=0.0003，图4c)。MYC+亚群呈现相对较高的 IPI 风险和较多的 BCL2/MYC 双表达病例；此外MYC+亚群中所有病例均为GCB-DLBCL，而 MYC-亚群中仅66.7%的病例为GCB-DLBCL （25.0%为ABC-DLBCL，8.3%为无法分类亚型）。EZB 样亚型中MYC+和 MYC-亚群的基因改变相似。

总生存期 (OS)方面，在 R-CHOP 治疗后，与 TP53WT 患者相比，TP53Mut患者在瑞金队列(P=0.0153)、BCC队列 (P=0.0042) 和 HMRN 队列 (P=0.0007) 中结局均不佳。此外在 BCC 队列和 HMRN 队列中，LymphPlex 算法的各基因亚型之间OS有显著差异（分别为P=0.0005和P<0.0001），但在瑞金队列中没有差异，可能是因为27.0%的患者随访少于5年。

鉴于 TP53Mut亚型独特的预后价值，作者进一步研究了 TP53Mut亚型的遗传标记。瑞金队列147例 TP53Mut患者中有116例 (78.9%) 携带 DNA 结合域 (DBD) 突变，16例 (10.9%) 携带非 DBD 突变，15例 (10.2%) 携带多个 TP53 突变。对接受 R-CHOP 治疗的患者进行生存分析，结果DBD 和非 DBD TP53 突变患者中未观察到 PFS 差异。为确定 TP53 突变对 DLBCL 的临床和生物学影响，作者分析了伴随 TP53 突变的分子学改变：结果在所有三个队列中，TP53突变均与 KMT2D 突变频率增加相关；此外在瑞金队列中，TP53Mut患者 EP300 和 NOTCH2 的突变显著增加，但 SOCS1 和 CD70 的突变减少；在 BCC 队列中，TP53Mut患者的 APF36L1 突变显著减少；在 HMRN 队列中，TP53Mut患者 EP300 和 NOTCH1 突变显著增加，但MYD88、EZH2和 IRF4 突变减少。基因功能方面，在瑞金队列中，TP53Mut患者呈现与干扰素-γ反应相关的突变减少；在 HMRN 队列中，TP53Mut患者中与T 细胞活化相关的突变减少，但与 Histone/DNA 甲基化相关的突变增加。

DLBCL各基因亚型的基因表达模式

作者利用瑞金队列中475例患者的 RNA 测序 (RNA-seq) 数据分析了基因表达谱，以更好地理解各基因亚型的生物学标签（图5）。这些亚型在不同的生物学过程中存在差异，TP53Mut和 MCD样亚型高度表达细胞增殖和 MYC 癌蛋白的特征，TP53Mut和EZB样MYC+亚型表达低水平的静止特征。基因亚型之间的代谢差异包括TP53Mut、MCD样和 BN2 样亚型中糖酵解途径的高表达特征，以及 TP53Mut亚型中脂质合成的高表达特征。

在本研究中，作者成功地开发了一种简化的 LymphPlex 算法，并定义了不同的基因亚型（TP53Mut、MCD样、BN2样、N1样、EZB样MYC+、EZB样MYC-和ST2样）。LymphPlex 算法的聚类显示与 LymphGen 算法有很好的一致性。

对1001例 DLBCL 患者的扩展验证揭示了各基因亚型的临床相关性和生物学特征：TP53Mut 亚型预后不良，以 p53 信号失调、免疫缺陷和 PI3K 活化为特征；MCD 样亚型与不良预后、ABC来源、BCL2/MYC双表达、NF-κB活化有关；BN2 样亚型在 ABC-DLBCL 中表现出良好的结局，并以NF-κB活化为特征；N1 样和 EZB 样亚型分别以 ABC-DLBCL 和GCB-DLBCL 为主；EZB样MYC+亚型的特征是免疫抑制性肿瘤微环境，而 EZB样MYC-亚型的特征是 NOTCH 激活；ST2 样亚型在 GCB-DLBCL 中表现出良好的结局，并具有 stromal-1 调节的特征。

总的来说，基因亚型的简化 LymphPlex 算法在 DLBCL 中具有较高的有效性和临床实用性，它是通过靶向测序和 FISH 揭示的少量基因改变实现的，可以应用于石蜡活检，而非冷冻活检，具有良好的临床可用性。同时，利用靶向测序数据代替 WES/WGS 数据可以输出 LymphPlex 结果，从而简化了数据分析的过程，保证其在多中心临床试验中的应用和基于基因亚型的靶向制剂的及时使用。这种简单但有效的算法有助于揭示 DLBCL 的分子异质性，转录组学分析与基因亚型整合可提供了分子特征的进一步证据，从而有助于在精准医疗时代设计基于机制的治疗，提出 DLBCL 的潜在靶向策略。