CRISPR技术进化史 | 24年 Cell 综述

引言

随着生命科学的不断进步，CRISPR基因编辑技术已经成为近年来最受瞩目的科学突破之一。其独特的机制、高效的编辑能力以及广泛的应用前景，使其在全球范围内受到了研究人员和研究机构的高度关注。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术，是一种利用RNA引导的DNA内切酶在特定位置切割DNA，从而实现基因编辑的方法。自2007年首次发现CRISPR-Cas系统在细菌中的自然免疫机制以来，研究人员经过不懈努力，逐步揭示了其工作原理，并将其转化为一种高效的基因编辑工具。

CRISPR技术的出现，为生命科学研究提供了前所未有的编辑精度和灵活性。它不仅能够在细胞层面上精确地修改遗传信息，还能在整个生物体级别上进行基因编辑，这对于疾病模型的构建、遗传病的治疗以及农业生物技术的发展等领域具有深远的影响。CRISPR技术能够精确地定位并修改生物基因组中的特定序列，为研究遗传病提供了强大的工具；通过精确修复或修改病理性基因突变，CRISPR技术为遗传性疾病治疗提供了新的可能；CRISPR技术的应用，能够提高作物的产量、抗性及营养价值，对全球食品安全产生积极影响。

随着CRISPR技术研究的深入，其在生物医药、农业、环境保护等领域的应用潜力不断被挖掘，对人类社会的发展产生了深刻的影响。而科学界对于其精确性、安全性和伦理性的持续探讨，也为CRISPR技术的健康发展提供了重要的指导。2月29日Cell杂志也对此发表了一篇综述“Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies”。

CRISPR基因编辑的过去

CRISPR技术的起源与发展

CRISPR技术的发现和发展是现代生命科学领域的一项里程碑，它不仅开辟了基因编辑的新纪元，也为未来的生物医药研究和应用提供了无限可能。

CRISPR技术的早期研究始于20世纪90年代，当时研究人员在一些细菌和古菌的基因组中发现了一些重复序列，这些序列之间由非重复的间隔序列分隔。这些重复序列和间隔序列的结构特征，后来被称为CRISPR。2005年，研究人员发现这些间隔序列与细菌感染的病毒DNA相匹配，揭示了CRISPR序列与细菌抵抗病毒感染之间的关系。2007年，Danisco的研究人员首次演示了CRISPR系统可以作为细菌的一种获得性免疫机制，防御外来遗传物质的侵入。

CRISPR-Cas9系统的识别与功能解析

CRISPR-Cas9系统的功能机制在2012年被Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier等研究人员揭示。他们发现，Cas9蛋白可以利用RNA分子作为引导，识别并切割特定的DNA序列。这项发现标志着CRISPR技术在精确基因编辑方面的巨大潜力。随后，CRISPR-Cas9系统因其简便、高效的特性迅速成为科学研究中的热门工具，被广泛应用于基因功能研究、遗传病治疗、农业生物技术改良等多个领域。

CRISPR基因组编辑的原理（Credit: Cell）

CRISPR技术的局限性

CRISPR技术虽然被誉为基因编辑领域的革命性工具，但其应用过程中依然存在一些不可忽视的局限性。这些局限性不仅影响了CRISPR技术的编辑精确性和特异性，也对编辑效率和递送系统提出了挑战。

精确性与特异性的挑战

CRISPR-Cas9系统在特定DNA序列上的切割能力虽然精确，但在实际操作中，仍有可能发生非特异性切割，即“脱靶效应”。这种现象可能导致非目标基因的意外编辑，进而引发细胞功能的异常甚至突变。

脱靶效应的成因：主要与引导RNA（gRNA）设计有关。gRNA与DNA的互补不完全可能导致Cas9错误识别目标，从而切割错误的DNA序列。

影响因素：脱靶效应的发生率受多种因素影响，包括gRNA的序列特异性、Cas9蛋白的表达水平以及细胞类型等。

为了减少脱靶效应，研究人员已经开发出多种策略和工具，如优化gRNA设计、使用高保真Cas9变体、采用脱靶检测技术等，以提高CRISPR技术的精确性和特异性。

编辑效率与递送系统的限制

CRISPR技术的编辑效率受到多种因素的限制，其中递送系统的选择和优化是关键因素之一。有效、安全地将CRISPR组件递送到目标细胞中，是实现高效基因编辑的前提。

递送方法：目前常用的CRISPR组件递送方法包括病毒载体递送、脂质体介导的递送和纳米粒子递送等。每种方法都有其优势和局限性，如病毒载体的递送效率高但可能引发免疫反应，而非病毒递送方法则安全性更高但递送效率较低。

细胞类型的限制：不同的细胞类型对CRISPR组件的接收能力不同，这也影响了编辑效率。例如，某些细胞类型对病毒载体的感受性较低，可能需要采用其他递送策略。

为了克服这些局限性，研究人员正致力于开发新的递送技术和改进现有方法，目标是实现更高效、更安全的CRISPR组件递送。

CRISPR基因编辑的局限性（Credit: Cell）

CRISPR基因编辑的现状

当前技术与应用

CRISPR技术自诞生以来，其在基因编辑领域的应用迅速拓展，特别是在基因治疗和农业生物技术研究中展现了巨大的潜力和实际价值。

CRISPR-Cas9在基因治疗中的应用

随着CRISPR-Cas9技术的不断成熟，其在基因治疗领域的应用逐步展现。通过精确修改或修复病理性基因，CRISPR-Cas9为遗传性疾病的治疗提供了新的可能。

遗传疾病的靶向修复：CRISPR-Cas9技术能够针对特定的遗传缺陷进行精确编辑，实现疾病相关基因的修复或功能性调控，为遗传病患者带来了新的希望。例如，针对β-地中海贫血和镰状细胞贫血等血液疾病的基因治疗已进入临床试验阶段。

癌症治疗的研究：利用CRISPR-Cas9技术靶向癌基因或肿瘤抑制基因，研究人员能够更深入地理解癌症的发生机制，并探索新的治疗方法。

CRISPR技术在农业和生物研究中的应用

在农业生物技术领域，CRISPR技术的应用正在重新定义作物改良和遗传研究的边界。

作物品种改良：通过CRISPR技术，研究人员可以精确编辑作物基因组，提高作物的产量、耐病性和营养价值。例如，通过编辑水稻和小麦中的特定基因，提高了其抗旱和抗病性能。

功能基因的研究：CRISPR技术在植物和动物模型中被广泛用于功能基因的鉴定和验证，加速了生物学基础研究的进展。

CRISPR基因编辑在人类健康领域的应用（Credit: Cell）

技术创新与优化

随着CRISPR基因编辑技术的快速发展，技术创新与优化成为推动该领域进步的关键因素。

高保真CRISPR系统的开发

为解决CRISPR-Cas9系统可能引发的脱靶效应问题，研究人员通过蛋白工程技术开发了高保真(Hi-Fi) CRISPR系统。这些高保真版本通过改良Cas9蛋白结构，显著降低了非目标DNA位点的切割，从而提高了基因编辑的特异性。

Cas9蛋白的改良：通过对Cas9蛋白的关键氨基酸进行突变，改变其与DNA的相互作用方式，从而减少对非目标序列的识别和切割。

编辑效率与特异性的平衡：高保真CRISPR系统在降低脱靶风险的同时，仍保持了较高的编辑效率，使其在临床研究和治疗应用中更加安全可靠。

CRISPR基因编辑技术的自动化与精密化

随着基因编辑技术的广泛应用，实验流程的自动化和精密化成为提高实验效率和准确性的关键。CRISPR技术的自动化不仅可以加速基因编辑项目的进展，还可以提高编辑的一致性和重复性。

自动化编辑平台：开发集成化的CRISPR编辑平台，通过软件控制实现高通量的样本处理、gRNA设计和筛选，以及基因编辑效果的评估，显著提升实验的效率和准确度。

精密化编辑工具：结合生物信息学工具和深度学习算法，优化gRNA的设计和选择，提高特定基因靶点的编辑精确度，减少脱靶效应的发生。

近年来的主要进展

CRISPR-Cas9和Cas12a系统的开发：这两种系统是CRISPR技术中的核心，它们通过简化的RNA引导机制使得基因组编辑变得高效和精确。CRISPR-Cas9主要来自于链球菌(Streptococcus pyogenes, SpCas9)，而Cas12a（以前称为Cpf1）提供了不同的PAM(Protospacer Adjacent Motif)识别和切割模式，扩展了CRISPR技术的应用范围。

碱基编辑技术（Base Editors, BEs）：通过将Cas9变体（缺少切割能力）与细胞色素脱氨酶（如APOBEC1）融合，开发出能够实现C到T（或G到A）编辑的基础编辑技术，避免了双链断裂（DSB）的产生，从而减少了可能引起的基因组不稳定性。

Prime Editors (PEs）：通过融合改造后的Cas9（nickase）和逆转录酶，能够引导更复杂的DNA修饰，如小范围插入、删除和单碱基替换，无需DSB或供体DNA模板，大大扩展了CRISPR技术的编辑能力。

CRISPR引导的重组酶和转座子技术：为了实现大片段DNA的精确插入，研究人员开始探索将CRISPR系统与重组酶或转座子结合的方法，这种方法不依赖于DSB，从而在细胞中插入大片段DNA时减少了基因组不稳定风险。

CRISPRi（CRISPR干扰）和CRISPRa（CRISPR激活）：两种利用CRISPR-Cas系统进行基因表达调控的技术。这两种方法都依赖于催化活性被阻断（失活）的Cas9蛋白（称为dCas9），它能够特异性地结合到DNA，但不会切割DNA。通过将dCas9与不同的效应分子融合，可以对目标基因的表达进行上调或下调，而不改变DNA序列。CRISPRi通过将dCas9融合到诸如KRAB（Krüppel-associated box）这样的转录抑制域，然后将这种构建物定向到基因启动子区域，从而阻止RNA聚合酶的结合和启动转录过程，达到抑制基因表达的目的。CRISPRi技术可以用来有效地降低特定基因的活性，用于功能基因组学研究和疾病模型的建立。CRISPRa则是通过将dCas9融合到转录激活因子，如VP64等，然后定向到特定基因的启动子或增强子区域，从而增强该基因的转录和表达。CRISPRa可以用于研究基因过表达对细胞功能的影响，以及开发潜在的治疗策略，特别是在需要增强某个保护性基因表达的情况下。

靶向RNA的沉默和修饰（Targeted RNA silencing and modifications）：通过特定的CRISPR-Cas系统，例如Cas13酶，针对RNA进行靶向沉默或修改的技术。这类技术的开发，为RNA层面的精确编辑提供了新的可能性，特别是在那些DNA编辑不是最佳选择的情况下。通过定向编辑mRNA，这种方法能够以可逆的方式调整基因表达，而不改变基因组DNA序列，从而在一定程度上降低了基因编辑的风险。此外，利用dCas13蛋白融合体进行的目标RNA修饰，还拓展了对RNA的编辑能力，包括但不限于增加m6A等表观遗传修饰。这些技术在基础研究、疾病模型构建以及未来的治疗策略中，展现了巨大的应用潜力。

人工智能（Artificial Intelligence, AI）在CRISPR中的应用：AI和深度学习技术正在被用于预测CRISPR编辑的结果，包括提高目标特异性和减少非目标编辑(off-target effects)。这些计算工具可以帮助研究者设计更有效、更安全的CRISPR编辑策略。

当前的CRISPR基因编辑技术（Credit: Cell）

CRISPR基因编辑的未来

新兴技术与方法

在CRISPR基因编辑技术快速发展的今天，新兴技术与方法的探索从未停止。

基因组编辑中的新兴技术（Credit: Cell）

更精确的基因编辑技术：随着对CRISPR技术了解的深入，研究人员正在研发更精确和高效的基因编辑工具。这包括针对更长或更复杂DNA序列的编辑技术，以及能够在非分裂细胞中高效工作的技术。

CRISPR引导的重组酶和转座酶：为了实现在分裂活动较少的细胞（如神经细胞）中进行高效的基因插入，研究人员正在开发新型的CRISPR引导的重组酶和转座酶系统。这些系统有望实现大片段DNA的精准插入。

基于逆转录过程的基因编辑技术：新型的基因编辑方法利用逆转录过程，允许更长的DNA片段插入目标基因组中。这为疾病模型的构建和遗传治疗提供了新的可能性。

表观基因组编辑：表观基因组编辑技术不改变DNA序列，而是通过修改基因表达的调控来达到治疗效果。这类技术对遗传治疗的安全性和伦理问题提出了新的解决方案。

RNA编辑技术：RNA编辑是一种相对较新的技术，它可以直接修改细胞内的mRNA分子，而无需改变DNA本身。这为治疗基因疾病提供了一种更安全、更可逆的方法。

人工智能在基因编辑中的应用：人工智能和深度学习算法在基因编辑领域的应用日益增多，它们有助于预测基因编辑的结果，提高编辑的精确度和效率，尤其是在治疗应用中的安全性和有效性。

CRISPR技术面临的挑战与机遇

随着CRISPR基因编辑技术的快速发展和广泛应用，其所面临的伦理、社会及法律监管挑战也日益凸显。

伦理与社会接受度的考量

伦理争议

CRISPR技术在基因疗法和基因改良方面的潜力巨大，但其可能引发的伦理争议也不容忽视。例如，基因编辑技术用于胚胎、生殖细胞的修改可能会对人类遗传基因产生永久性影响，引起广泛的伦理和道德讨论。社会对基因编辑技术的接受程度不一，不同文化和宗教背景下，人们对于基因编辑的态度和看法各异，这对技术的推广和应用构成了挑战。

遗传公平性

基因编辑技术的应用还引发了遗传公平性的问题，即技术可能加剧社会不平等，使得基因编辑成为富裕阶层的专利，而忽略了对广大弱势群体的影响。

法律与监管框架的发展

法律监管

随着CRISPR技术的飞速发展，各国政府和国际组织正努力建立相应的法律和监管框架，以确保技术的安全、有效和伦理应用。监管框架的建立涉及到技术使用的范围、研究资格的限制以及审批流程的严格规定。在全球范围内，对CRISPR技术的法律监管还需要国际间的合作和标准化，以促进科学研究的同时，防止技术滥用和伦理风险。

监管挑战

制定与CRISPR技术发展相适应的法律监管政策是一项挑战，需要在促进科技创新与保障公众利益之间找到平衡点。同时，监管机制需要具有一定的灵活性，以适应技术进步带来的新情况和新挑战。

CRISPR技术的未来发展不仅需要研究人员的不懈探索和创新，还需要伦理学家、法律专家、政策制定者以及公众的共同参与。通过全面考虑伦理和法律问题，制定合理的监管措施，CRISPR技术才能在确保安全和伦理的基础上，为人类带来更多福祉。

对未来研究方向的建议

提高编辑效率和精确性：继续优化CRISPR系统，降低脱靶效应，提升基因编辑的准确度和安全性。

扩展CRISPR系统的多样性：研究和开发新的CRISPR系统，如Cas12、Cas13等，拓展基因编辑的可能性和应用范围。

增强递送系统的有效性：改进CRISPR组分的递送方法，确保其能够更有效、更安全地到达目标细胞。

促进伦理和法律研究：与伦理学家、法律专家合作，研究和制定适应技术发展的伦理指导原则和法律规范。

加强跨学科合作：推动生物学、医学、伦理学、法律和社会科学等领域的合作，促进CRISPR技术全面、均衡的发展。

Q&A

CRISPR基因编辑技术是如何工作的？

CRISPR-Cas9技术基于一种天然存在于细菌中的免疫机制，用于识别并切割外来的遗传物质，如病毒DNA。在实验室设置中，研究人员可以设计特定的RNA序列（引导RNA），使其与目标DNA序列精确配对，并指导Cas9酶到达并切割这个DNA位点。这一过程允许研究人员在基因组特定位置进行添加、删除或替换基因片段，从而实现对遗传物质的精确编辑。

CRISPR技术能治疗哪些疾病？

CRISPR技术在治疗多种遗传性疾病方面展现出巨大潜力，包括但不限于：

- 遗传性血液疾病，如镰状细胞病和β-地中海贫血；

- 遗传性视网膜疾病，可能恢复或改善患者视力；

- 某些类型的肿瘤，通过编辑免疫细胞以更有效地识别和攻击癌细胞；

- 遗传性肌肉疾病，如杜氏肌营养不良症。

使用CRISPR技术进行基因编辑有哪些风险？

尽管CRISPR技术具有革命性的潜力，但其应用也伴随着一定的风险和挑战，包括：

- 脱靶效应：编辑工具可能会错误地识别并切割非目标DNA序列，可能导致意外的基因突变；

- 遗传物质的非预期变化：即使在目标位点成功编辑，也可能引发复杂的基因交互作用，导致不可预测的后果；

- 伦理和社会问题：特别是涉及人类胚胎编辑的应用，可能引起广泛的伦理和社会担忧。

CRISPR技术在未来的应用前景如何？

未来，CRISPR技术的应用前景广阔，不仅限于医学领域，还将扩展到农业、生物研究甚至生物计算等多个领域。在医学上，随着编辑精度的提高和递送系统的改进，CRISPR有望为更多的遗传性疾病提供治疗方案。在农业上，通过改良作物的遗传特性，可以增强作物的耐病性、产量和营养价值。此外，CRISPR技术的进一步研究和创新，将不断拓宽人类对生命科学的认知和应用能力，为人类社会带来更广泛的福祉。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.042

Pacesa M, Pelea O, Jinek M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell. 2024;187(5):1076-1100. doi:10.1016/j.cell.2024.01.042