双特异性抗体之T细胞结合器，改变肿瘤免疫治疗！

迄今为止，与传统的抗癌治疗策略相比，免疫治疗被认为是最有前景的全身性肿瘤治疗方法，其中，单克隆抗体因其特异性靶向分子的能力，已成为癌症治疗中一种关键而有效的治疗方式。然而，由于肿瘤复杂的疾病发病机制，针对单一靶点的单克隆抗体往往不足以表现出足够的治疗效果。因此，针对多个靶点的双特异性抗体（bsAbs）应运而生，它的发展改变了肿瘤免疫治疗的领域。

由于能够同时针对肿瘤细胞或肿瘤微环境（TME）中的两个表位，bsAbs逐渐成为下一代治疗性抗体的一个重要和富有前景的组成部分。目前正在开发的大多数bsAbs被设计成T细胞结合器，通过将免疫细胞，特别是细胞毒性T细胞，与肿瘤细胞紧密相连，从而形成一个人工免疫接触，最终导致靶向肿瘤细胞的选择性攻击和裂解。目前，许多临床前和临床试验正在进行中，肿瘤免疫治疗进入了双抗时代。

BsAbs最初的概念是由AlfredNisonof在20世纪60年代首次提出的。他将两个不同的抗原结合位点结合在一个分子中，并从抗牛γ球蛋白和抗卵清蛋白单价片段的混合物中获得了一个具有双重特异性的F(ab’)2分子。

1975年，Köhler和Milstein发明了杂交瘤技术，最终解决了生产单克隆抗体的问题，开启了单克隆抗体治疗的新时代。1983年，Milstein和Cuello开创了quadroma技术，该技术基于分泌Abs混合物的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，包括具有双重特异性的鼠IgG形式的bsAb。然而，bsAb的低产率以及难以从密切相关的错配副产物中纯化所需的Ab是一个重大问题。

1988年，James Huston和他的同事发明了单链抗体片段（scFv），它最大限度地减少了复性问题，例如不正确的结构域配对或聚集。1996年，Genentech的科学家们利用重组DNA技术发明了knob-into-hole技术，克服了Quadrome技术的局限性。通过在人类IgG的CH3结构域之间的界面突变选定的氨基酸，可以减少IgG重链的错配。这种技术利用更有利的蛋白质相互作用，最终可以形成高达90%的正确双特异性重链配对。随后，随着抗体工程和生物学的进展，bsAb的不同概念和结构正在不断演变。

目前，许多bsAb已被开发为治疗实体癌和血液癌的药物。截至2021年12月，3种类型的bsAb已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于诊所治疗癌症。

抗体由四条多肽链组成，分子量较大的两条链称为重链(H链)，而分子量较小的两条链称为轻链(L链)。在单抗中，两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同，而双特异性抗体的开发是通过共表达两条不同的H链和两条不同的L链。从10种可能的H2L2重组混合物中获得功能性双特异性抗体是双特异性抗体开发的最初挑战之一，这通常称为链相关问题。 

在过去几十年里，研究者们已经开发了许多策略，以解决这一问题。由这些策略诱导的不同设计特征或功能特性可用于所产生的双特异性抗体模式的分类。             

基于片段的模式（Fragment-based formats） 

基于片段的双特异性抗体简单地将多个抗体片段结合在一个分子中，不含Fc区域（fragment crystallizable，可结晶片段，与抗原结合片段Fab相对），避免了链相关问题，优势是产量高、成本低；缺点是半衰期相对较短。此外，基于片段的双特异性抗体可能会出现稳定性和聚合问题。 

对称模式（Symmetric formats） 

对称模式的双特异性抗体保留了Fc区域，更接近于天然抗体，但在大小和结构上有所不同。这些差异可能对与天然抗体相关的有利特性(如稳定性和溶解度)产生负面影响，从而可能损害这些双特异性抗体的理化和/或药代动力学特性。 

不对称模式（Asymmetric formats） 

大多数不对称模式的双特异性抗体与天然抗体非常相似，被认为具有最低免疫原性的潜力。不过，解决链相关问题可能涉及到的复杂工程可能会抵消一些不对称模式双特异性抗体的这一优势。

根据其功能机制，BsAb可分为4类：结合同一抗原的两个表位、细胞-细胞接合器、双功能调节剂和细胞治疗中的BsAb。其中，T细胞接合器是临床研究中应用最广泛的形式，已被证明能诱导肿瘤特异性免疫细胞激活。

结合同一抗原的两个表位

人们已经开发了同时针对同一靶抗原内2个不同表位的双副表位抗体。例如，靶向癌胚抗原（CEA）或VEGF2的bsAb被开发用于治疗癌症。人们还开发了几种bsAb来中和病毒抗原，例如，针对HBV表面抗原和HIV-1包膜蛋白的bsAb显示出针对同源抗原的中和活性。

细胞接合器

细胞接合器连接两种不同类型的细胞，主要是肿瘤细胞和T/NK细胞，以诱导肿瘤细胞溶解。细胞接合器由TAA靶向部分和效应细胞识别部分组成，并进一步分为T细胞接受器和NK细胞接受器。

T细胞接合器利用TAA和TCR成分（主要是CD3），它们连接肿瘤细胞和T细胞，绕过TCR-MHC-I相互作用。因此，无论抗原特异性如何，T细胞结合器都会触发T细胞活化，产生包括穿孔素和颗粒酶在内的细胞毒性分子，以杀伤肿瘤细胞。

BiTE是T细胞结合器的一种形式，通过靶向TAA和CD3的单链抗体将肿瘤细胞和T细胞结合，用于T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。靶向CD19和CD3的blinatumomab是临床上典型的BiTE，2014年，blinatumomab成为第一个被FDA批准的BsAb，用于治疗ALL患者，在随后的几年里，blinatumomab的治疗范围进一步拓宽，2018年，FDA批准其用于首次或第二次完全缓解后MRD≥0.1%的pre-B ALL患者群体的治疗。目前，超过60例BiTE形式的双抗正在进行I/II期临床试验。

NK细胞接合器将CD16A+NK细胞重定向至肿瘤细胞，诱导NK细胞活化。与BiTE相比，NK细胞接受者表现出较少的不良反应，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。多种细胞毒性受体可激活NK细胞：CD16（FcγRIII）、天然细胞毒性受体（NCR；NKp30、NKp44、NKp46）、C型凝集素样受体NKG2D（CD314）和CD94/NKG2C。最近，抗CD30×CD16A的NK细胞接合器（AFM13）在AACR 2022的报告中展示了不俗的抗肿瘤效果。

双功能调制剂

双功能调节剂同时结合两种不同的免疫共刺激或共抑制分子，诱导靶细胞的功能改变。大多数双功能调节剂靶向PD-1/PD-L1轴和其他免疫抑制分子，如CTLA-4（CD152）、TIM-3、LAG-3或TIGIT。MEDI5752（PD-1×CTLA-4）抑制PD-1+激活的T细胞中CTLA-4的功能，诱导PD-1的快速内化和降解。与PD-1和CTLA-4单抗联合治疗相比，MEDI5752的活性显著增强。针对其他检查点分子的双功能性抑制剂，包括LAG-3和TIGIT，也正在开发中。

过继细胞治疗中的bsAbs

尽管CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出疗效，但也观察到了副作用，包括CRS、神经毒性和靶向非肿瘤效应。为了将不良反应降至最低，正在进行用BsAbs体外激发T细胞的研究。与单独的BsAb和T细胞输注相比，在体外BsAb武装的T细胞治疗可诱导强烈的抗肿瘤反应，有效渗透到肿瘤部位，并减少细胞因子的释放，从而将系统不良反应降至最低。

OKT3×hu3F8 BsAb武装T细胞（GD2BATs）在体外诱导特异性杀伤GD2阳性神经母细胞瘤和骨肉瘤细胞系。在GD2阳性肿瘤患者的I期试验中，GD2BATs在一些患者中显示出临床反应，且无明显副作用。

BiTE和CAR-T细胞疗法之间有明显的相似性。和BiTEs一样，CAR-T细胞能够通过可变的TAA靶向抗原结合域（通常是单链抗体）识别肿瘤细胞。然而，与BiTEs激活不同的是，T细胞不是通过内源性TCR复合物激活的，而是通过来自CD3和共刺激分子（如4-1BB和CD28）的细胞内信号转导域激活的，这些区域被整合到一个合成的细胞表面受体中，细胞外部分含有单链抗体（即CAR）。因此，用CAR结构转导患者的T细胞会导致这些效应细胞针对选定的靶TAA重新定向，从而发挥对肿瘤细胞的杀伤。与BiTE的生产不同，CAR-T细胞制造需要体外基因修饰和细胞扩增，特别是自体T细胞，这是一个相对低效、资源密集、耗时且成本高昂的过程。

T细胞与靶细胞之间免疫突触的形成，细胞的连续杀伤能力，以及细胞溶解蛋白如穿孔素和颗粒酶的定向释放，是CAR-T细胞和BiTEs共同的作用模式特征。此外，BiTEs和CAR-T细胞都是通过CD8+T细胞和CD4+T细胞发挥其效应功能。然而，体外和体内研究表明，来自低分化和未接触抗原的T细胞亚群，如干细胞记忆T细胞（Tscm）或中心记忆T细胞（Tcm）的CAR-T细胞具有优越的抗肿瘤活性、增强的扩增能力和持久的存活期，而BiTE介导靶细胞死亡主要通过抗原经历的T细胞在激活后分化为效应记忆T（Tem）细胞。

CiTE

双功能检查点抑制性T细胞接合器（CiTEs）将局部限制性免疫检查点抑制功能与BiTEs的T细胞重定向功能结合在一个分子中。CiTEs将PD-1/PD-L1的抑制性功能局限在靶向TAA相互作用的重定向T细胞局部，因此，该分子BiTE部分的功效得到增强，同时避免了与抗PD-1或抗PD-L1 ICI相关的T细胞的全身活化，从而限制了与免疫有关的不良事件的风险。

这种新型T细胞接合器的概念证明已在AML的临床前模型中得到验证。基于类似的机制，Horn等人已经开发出一种抗PD-L1–CD3的BiTE，它同时将内源性T细胞和NKT细胞重新定位到PD-L1+细胞。临床前研究表明，当与其他不能中和PD-1/PD-L1介导的免疫抑制的免疫疗法联合使用时，这种形式的CiTE可能对PD-L1表达的实体瘤患者有效。

 SMITE

同时多重相互作用BiTE（SMITEs）是另一种创新的T细胞参与治疗形式。SMITEs由两个单独的BiTE组成，每一个都针对不同的抗原，其中一个以CD3为靶点，在与靶TAA结合时诱导TCR信号，而另一个靶向CD28以提供T细胞共刺激信号。例如，含有抗PD-L1–CD28 BiTE的SMITEs可通过CD28与T细胞的结合将抑制性PD-L1信号转化为正向的共刺激信号，这些T细胞通过第二个TAA特异性和CD3靶向的BiTE进一步潜在地共同激活。SMITEs可以在任何一种BiTE的最低活性浓度甚至更低的浓度下，依然发挥有效作用。SMITE平台不仅提供了克服由免疫检查点蛋白介导的抵抗机制的机会，而且还可以靶向更广泛的细胞表面TAA，以提高肿瘤的特异性，同时限制免疫逃逸的风险。

TriKE

增强效应细胞细胞毒性的另外一种形式是三特异性杀伤接合器（TriKEs），其主要目的是利用NK细胞对抗癌细胞的活性，并包含与免疫刺激细胞因子相连的双特异性抗体。一种抗CD33-CD16/IL-15的TriKE能将NK细胞定向到髓系母细胞，目前正在AML患者中进行临床研究（NCT03214666）。

DART

改变“典型”BiTE的结构可以提供多种新的治疗方法。例如，新的双亲和力再靶向蛋白（DART）已经被开发出来，它们具有比BiTEs更有利的结构和生物学特性，包括更大的稳定性和将T细胞毒性靶向恶性细胞的最佳重定向。DART分子是由提供双重抗原结合位点的两个Fv链组成的双特异性diabody，通过二硫键和非共价键组装，从而提高稳定性并限制链内域相互作用 

DARTs的结构使目标和效应细胞之间的最佳交互作用成为可能，从而产生高水平的靶细胞杀伤。在临床前模型相比，DARTs比BiTEs表现出更好的细胞毒性。在临床前模型中，DART分子已成功应用于NK细胞或T细胞对恶性B细胞的再靶向（抗CD16–CD32B DART或抗CD19–CD3 DART duvortuxizumab，也称为MGD011）和T细胞向CD123+AML细胞的再靶向（flotetuzumab；MGD006）或糖蛋白A33表达的胃肠道癌细胞（gpA33；MGD007）；这些药物大多已进入临床开发阶段（NCT02454270、NCT02152956、NCT03739606、NCT02248805和NCT03531632）。

重要的是，DART分子可被设计成包含Fc结构域（例如，duvortuxizumab、gpA33和PRS-343），其半衰期更长，因此有助于使用更方便的间歇给药，而不是连续输注。

CrossMAb 

传统的BiTEs是对称设计的，CD3和TAA为1:1，通过1:2设计增加结合能力可能提高对肿瘤细胞的识别，同时避免在TAA缺失的情况下CD3在T细胞上的激活。一种被称为CrossMAb技术的创新设计平台能够以完整的IgG形式生成1:2价的双特异性抗体。Cibisatamab（又称CEA-TCB）是一种CrossMAb 形式的双抗，CD3和CEA的效价为1:2。Cibisatamab于2014年进入I期试验，目前正在表达CEA的实体瘤患者中进行研究（NCT02324257和NCT02650713）。

第一阶段的结果显示了很好的疗效并诱导出高度炎症性的TME。同时，至少有8种基于IgG的双特异性抗体已经使用CrossMAb技术进行开发，目前正在进行临床研究或处于临床前开发后期。其中抗CD20–CD3的REGN1979对NHL患者有良好的疗效。

 ImmTACs

抗癌免疫动员单克隆T细胞受体（ImmTACs）是一种新型的双功能抗体药物，结合了基于TCR的靶向系统和抗CD3单链抗体效应器功能。因此，这些分子可以将多克隆效应性T细胞重定向到肽-MHC复合物中呈现的TAAs或肿瘤特异性新抗原，包括来自细胞内蛋白质的抗原。通过利用可溶性高亲和力单克隆TCR结构域促进大量多克隆效应T细胞的招募，这类分子有潜力以现成的形式克服非炎性环境的TME。

Tebentafusp是第一个ImmTAC，靶向黑色素瘤相关抗原gp100与HLA-a*02:01复合物呈递的多肽；这种药物已经在晚期葡萄膜黑色素瘤患者中显示出临床活性，并于2016年被FDA授予孤儿药资格，并于2019年获得快速通道资格。

在过去的30年里，人们目睹了一个巨大的转变，从仅仅开发和改造基本的Abs，发展到更复杂的Ab衍生物，其形状和尺寸多种多样，尤其是bsAb。bsAb技术在临床应用中具有非凡的前景，吸引了研究人员的注意并已发展出极为丰富的形式，为基于BSAB的癌症免疫治疗奠定了坚实的基础。

目前临床试验中的大多数bsAb（67%）旨在对抗血液恶性肿瘤。相比之下，靶向实体肿瘤的bsAb值得进一步研究，因为其对正常组织或其他复杂因素（包括免疫耐受性癌间质、新生血管紊乱，bsAb药物的渗透不足）有不可避免的不良影响。因此，人们对正在进行的实体肿瘤中的bsAb研究充满热情，这些研究有望在不久的将来产生有希望的结果。总之，bsAb研究的结果证明了这些分子在新的药物设计和随后的癌症治疗临床应用中具有良好的前景。

参考文献：

1.Development of Bispecific Antibody for CancerImmunotherapy: Focus on T Cell Engaging Antibody. Immune Netw. 2022 Feb; 22(1): e4.

2. T cell-engaging therapies - BiTEs and beyond. Nat Rev Clin Oncol. 2020 Jul;17(7):418-434.