IVD技术丨基于液体活检的胰腺癌早期诊断

液体活检等微创方法为早期PC检测带来了希望。临床中广泛应用的胰腺肿瘤血清学标志物是CA19-9，但其在特异性、敏感性和对总生存期(OS)等结果的预测价值方面受到了挑战。其他血液生物标志物，如循环肿瘤细胞(CTCs)、外泌体、循环肿瘤DNA (ctDNA)或cfDNA，在其临床适用性和作为生物标志物的验证方面存在主要障碍。例如，ctDNA/cfDNA在PC中应用的主要挑战之一是外周DNA水平极低，这可能对早期疾病敏感性产生重大影响。ctDNA中的DNA甲基化分析需要更多资源，这限制了该技术在常规使用中的临床应用。相比之下，成熟的miRNA在体液中高度稳定，并在不同的癌症类型中表现出特殊的特异性，体液中肿瘤miRNA标志物的筛选在协助疾病的早期诊断和纵向监测治疗成功方面具有重要的临床价值。

近日，一组来自德国的研究团队在杂志British journal of cancer上发表了一篇题为“Integrating a microRNA signature as a liquid biopsy-based tool for the early diagnosis and prediction of potential therapeutic targets in pancreatic cancer”的文章。作者将机器学习算法与现实世界和公共数据库分析相结合，用于PC中循环miRNA的早期筛选。通过四种机器学习方法，使用最热门的候选标记物来评估预测胰腺癌的准确性。最后，作者探讨了临床预后价值，候选靶点，并预测可能涉及的调节细胞生物学机制。研究表明，此研究结果可能有助于进一步发展早期检测策略，通过使用微创筛查工具进行PC诊断和预后。

图片来源：British journal of cancer

主要内容

与邻近非肿瘤组织相比，胰腺癌血清和组织样本中的miRNA上调

作者分别在实验室组织数据集(OLMS-T , 13 PC vs. 13 HT samples)以及GSE112264 (50 PC vs. 41 HT samples)和GSE109319 (24 PC vs. 21 HT samples)的血清数据集中分析了PC正常组织和肿瘤组织之间的miRNA表达情况。结果显示，OLMS-T数据集中PC组织中有66个差异化表达miRNA(DEM)上调，GSE112264和GSE109319数据集中PC血清中分别有418和267个DEM上调(图a-c)。作者选择RRA方法选择在肿瘤组织和血清中均表达升高的关键miRNA。作者选择了四种miRNA包括hsa-miR-6819-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-205-5p和hsa-miR-191-5p(图d)。实验室验证这四种miRNA在患者血清中的表达时，将hsa-miR-6819-5p排除 (图e)。

差异基因表达分析及特征miRNA鉴定。

图片来源：British journal of cancer

血清miRNA可准确预测胰腺癌的存在

在训练集中，随机森林（RF）算法显示三种miRNA(hsa-miR-1246, hsa-miR-205-5p和hsa-miR-191-5p)可以预测PC，准确率高达95.8%(图a)。CART、SVM和LR算法也显示出较高的预测精确度。曲线下面积分别为0.868、0.830、0.823(图b-d)。在测试数据集中，这三种miRNA也比传统的血清标志物显示出更好的预测PC的准确性。四种方法的预测模型准确率分别为94.4%、84.9%、82.3%和83.3%(图e-h)。在真实世界研究中，根据RF算法，该miRNA特征可以根据血清样本区分PC患者和健康患者，准确率为82.3%(图i);CART的准确率为83.5%，SVM的准确率为79.0%，LR的准确率为82.2%(图j-l)。

四种机器学习算法验证了microRNA panel的预测效果。

图片来源：British journal of cancer

血清miRNA特征区分胰腺癌和慢性胰腺炎

本研究共纳入了三个PC和慢性胰腺炎数据集，下图a显示了这些参与者的基线信息。在倾向评分匹配（PSM）之前，区分PC和胰腺炎的血清miRNA特征的预测准确率为84.5%(图b)。在PSM消除了3个数据集之间的基线差异之后，使用随机森林分析，此miRNA特征在患者血清中区分胰腺炎和PC的可预测性提高到91.5%的准确性(图d)。

三种血清miRNA panel可以区分胰腺炎和胰腺癌。 

图片来源：British journal of cancer

血清hsa-miR-205-5p的高表达与临床预后差和肿瘤切除不完全相关

分析hsa-miR-205-5p在TCGA-PAAD队列中的表达时，作者发现性别、年龄或种族之间没有显著差异，但在高T期或疾病组织学分级阶段较晚的患者中转录物丰度增加(图d, e)。R1/2切除组的血清hsa-miR-205-5p表达高于R0切除组(图f)。这些结果表明，hsa-miR-205-5p可以作为更晚期疾病的预测标志物。此外，在生存分析中，高表达hsa-miR-205-5p的患者在OS、DSS和PFI方面的预后总是比低表达hsa-miR-205-5p的患者差(p = 0.05, p = 0.011, p = 0.002)(图g-i)。

新型血清生物标志物hsa-miR-205与临床因素的关联。

图片来源：British journal of cancer

预测胰腺癌中hsa-miR-205-5p的上下游靶点

CLIP(交联免疫沉淀)数据共预测了hsa-miR-205-5p的1616个候选靶点，基因本体富集分析表明，这些靶点可在上皮细胞迁移、自噬和细胞-细胞粘附连接中富集(图a-c)。信号通路分析表明，上述靶点可能参与TGF-β信号通路以及系统发育保守的干细胞信号通路，如Wnt和Hedgehog信号通路(图d)。

为了确定可能的下游靶点，在对hsa-miR-205-5p与其在PC中的靶点进行相关性分析后，作者发现只有BMP激活素膜结合抑制因子(Activin Membrane-Bound Inhibitor, BAMBI)的表达与hsa-miR-205-5p的表达水平呈显著(负)相关。作者进一步探索BAMBI基因在PC中的潜在机制，途径富集结果表明该基因可能参与Wnt信号通路和TGF-β信号通路(图f)。考虑到hsa-miR-205-5p也在相同的通路中富集，作者推断hsa-miR-205-5p可能靶向BAMBI激活TGF-β通路，进而促进胰腺癌的发生。

预测hsa-miR-205及其候选靶点BAMBI的机制功能。

图片来源：British journal of cancer

BAMBI mRNA高表达与胰腺癌患者更好的临床预后相关

BAMBI可能受hsa-miR-205-5p的调控，其表达趋势与hsa-miRNA 205-5p的表达负相关。与此一致的是，作者发现随着疾病分期的增加，该基因的表达水平降低(图g-i)。此外，生存分析结果显示，BAMBI mRNA在PC中的高表达表明预后较好，包括延长的OS、DSS和PFI(分别为p = 0.024、p = 0.049和p = 0.007)(图j - l)。

BAMBI mRNA高表达与胰腺癌患者更好的临床预后相关

总结与讨论

在这项研究中，一组三种miRNA (hsa-miR-1246, hsa-miR-205-5p和hsa-miR-191-5p)被用来预测独立于疾病分期的PC。量化患者血清中hsa-miRNA 205-5p的转录水平可能有助于改善胰腺炎患者与肿瘤患者的分层，并有助于告知外科医生围手术期肿瘤区域切除的完整性。潜在的机制和所提出的策略识别肿瘤亚型的效用需要在后续研究中进行评估。工作的另一个成果是发现BAMBI的转录激活作为PC的潜在靶点， BAMBI被鉴定为TGF-β信号的抑制基因，受hsa-miR-205-5p调控。

本研究的局限性：首先，发现队列从单个中心入组的患者数量相对较少，临床结果数据仅依赖于公共数据集。为了解决这个问题，需要进行一项专门的前瞻性临床试验，对三种候选miRNA在PC患者中的价值进行基准测试，并进行临床随访。此外，由于分析的肿瘤样本的DNA突变状态的可用数据深度不足，作者无法确认此测试在遗传肿瘤亚型之间的区分的任何效用。此外，生物标志物分析是基于超灵敏的下一代测序数据采集。湿实验室验证试验的执行，理想情况下是在如上所述的前瞻性收集的样本上，使用靶向RNA定量，如RT-qPCR或CRISPR/Cas诊断，有助于验证发现。

总之，一个由三个miRNA组成的panel在真实数据中具有较好的统计预测性能。循环hsa-miRNA 205-5p血清水平可作为胰腺癌诊断和疾病分期的微创早期检测工具，并可能有助于监测治疗成功。