Sci Adv 山东大学齐鲁医院张澄教授/张运院士团队发现NPRC在糖尿病性心肌病中的作用及机制

随着生活方式的发展，糖尿病在全球的发病率逐年升高，成为威胁人类健康的重要疾病之一，也是心血管事件的独立危险因素。糖尿病性心肌病(DCM)是由糖尿病引起的以左心室收缩或舒张功能障碍为特征的疾病，其病理表现包括心肌纤维化、心肌肥厚和炎症等，已成为糖尿病患者主要的死亡原因之一。心肌纤维化可导致心脏僵硬度的增加和顺应性降低，影响心室舒张和收缩功能，是DCM的主要病理特征。然而，目前仍缺乏以循证医学为证据的改善糖尿病心肌纤维化的治疗手段。因此，探讨糖尿病心肌纤维化的新机制和干预新靶点是DCM研究领域中的重要课题。

利钠肽(NPs)家族作为重要的神经体液因子，在心血管系统中的作用越来越受到关注。NPs主要包括3种肽链即心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、 C型利钠肽(CNP)和它们的3种受体，即GCA、GCB和NPRC。三种受体胞内段的差异是导致受体间不同功能的主要原因。在结合NPs后，GCA和GCB通过胞内偶联的鸟苷酸环化酶(GC)，促进环磷酸鸟苷(cGMP)的生成，并激活下游蛋白激酶G(PKG)相关信号通路。NPs通过GCA和GCB可在体内发挥多种心血管保护作用如利钠、利尿、舒张血管、降低血压、抑制病理性心肌纤维化及心室重构、促进脂肪棕色化等。但不同于GCA和GCB，NPRC的胞内段未偶联GC，但含有抑制性鸟苷酸调节蛋白(Gi)的激动序列，可激活Gi，抑制环磷酸腺苷(cAMP)的生成，从而抑制cAMP下游靶点如蛋白激酶A(PKA)等。

此外，NPRC通过内化和降解NPs，从局部细胞外环境或循环中清除NPs，维持其动态平衡，因此也被称为“清除受体”。研究发现，心脏中NPRC的分布密度明显高于其他两种受体，但关于NPRC在心脏中的作用尚不明确。迄今为止，尚无研究报道NPRC在DCM中的作用及机制。

2023年8月2日，山东大学齐鲁医院心内科、络病理论创新转化全国重点实验室张澄教授和张运院士团队在Science Advances在线发表了题为“NPRC deletion attenuates cardiac fibrosis in diabetic mice by activating PKA/PKG and inhibiting TGF-β1/Smad pathways”的研究论文，阐述了NPRC基因敲除减轻DCM小鼠的心肌纤维化从而保护小鼠心功能的作用及机制，可能为研发以NPs为基础的DCM心肌纤维化的治疗手段提供了潜在靶标。

首先，为探索NPRC与DCM发病和进展的关系，研究人员给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ并继续喂养16周，构建了DCM模型。结果显示，与对照组相比，DCM小鼠心脏NPRC的表达水平明显上调，而GCA和GCB的表达水平无明显改变。同时，研究人员对拟行心脏移植手术且无明显冠脉狭窄的糖尿病心衰患者的心脏组织进行了检测，发现相比于健康捐献者，糖尿病心衰患者的心脏NPRC表达水平明显升高。细胞水平上，高糖(HG)刺激可显著上调原代新生大鼠心肌成纤维细胞(NRCFs)和人诱导多功能干细胞分化的心肌成纤维细胞(hiPSC-CFs)的NPRC表达水平。以上结果提示，NPRC可能参与DCM心肌纤维化的发生和发展。

为了研究NPRC在DCM发生和发展中的作用，研究人员构建了NPRC基因敲除(NPRC^-/-)小鼠，并给予NPRC^-/-小鼠和同窝对照WT(NPRC^+/+)小鼠STZ注射以构建糖尿病模型，16周后行安乐死并取材。超声心动图显示，NPRC基因敲除改善了糖尿病小鼠的左室重构及左室收缩和舒张功能。病理染色和分子生物学检测提示NPRC基因敲除减轻了糖尿病小鼠的心肌间质和管周纤维化及胶原沉积，抑制了DCM心肌纤维化经典通路TGF-β1/Smad通路的激活。为了进一步排除心脏外组织NPRC敲除的影响，研究人员使用了9型AAV(AAV9-shNPRC)以干扰心脏NPRC的表达。结果同样提示，NPRC基因敲减抑制了糖尿病小鼠的心肌纤维化和胶原沉积，改善了左室重构和功能。

接下来，研究人员探究了NPRC基因干预对心肌成纤维细胞功能的影响。由于NPRC的作用包括抑制胞内cAMP/PKA信号通路和清除胞外NPs，NPRC基因干预可能会影响胞内的信号通路和胞外的细胞通讯。因此，研究人员将体外实验分为两部分进行。第一部分体外实验中，研究人员使用小干扰敲低了心肌成纤维细胞的NPRC表达，并给予正常糖(NG)和HG刺激，结果提示NPRC基因敲减可抑制心肌成纤维细胞的胶原合成和增殖及TGF-β1/Smad通路的激活；第二部分体外实验中，研究人员首先使用小干扰敲低了心肌细胞的NPRC表达，并给予正常糖(NG)和HG刺激，随后利用处理后的心肌细胞上清刺激心肌成纤维细胞，发现心肌细胞NPRC敲减同样可抑制心肌成纤维细胞的胶原合成和增殖及TGF-β1/Smad通路的激活。

下一步，为研究NPRC基因干预是如何调控心肌成纤维细胞的功能，研究人员对NPRC敲减后的心肌成纤维细胞进行了转录组测序，并筛选出关键分子TGIF1。通过免疫荧光、Co-IP和Western blot检测，研究人员发现NPRC基因干预通过上调心肌成纤维细胞的TGIF1表达水平，阻止Smad2/3磷酸化的关键蛋白cPML由细胞核向细胞质的转移，从而减少了Smad2/3的磷酸化，导致心肌成纤维细胞的胶原合成和增殖受到抑制。NPRC基因干预对心肌成纤维细胞功能的调控作用可被TGIF1的敲减部分抑制。随后，研究人员对NPRC影响的胞内信号通路和胞外NPs水平进行了检测以明确NPRC干预上调TGIF1的具体机制。首先，心肌成纤维细胞NPRC敲减可上调细胞内cAMP水平，激活PKA通路。其次，心肌成纤维细胞和心肌细胞的NPRC敲减可减少细胞外NPs的清除，而增加的NPs分别以自分泌和旁分泌的方式，升高心肌成纤维细胞的cGMP水平，激活细胞内PKG通路。NPRC敲除小鼠的心脏组织中同样发现了cAMP/PKA和cGMP/PKG通路的激活。

随后，为探索cAMP/PKA和cGMP/PKG通路的激活与TGIF1及TGF-β1/Smad通路的关系，研究人员首先给予心肌成纤维细胞cAMP/PKA通路的激活剂和抑制剂处理，发现PKA的激活可通过降低TGF-β1和上调TGIF1的表达水平协同抑制TGF-β1/Smad通路的激活；其次，研究人员给予心肌成纤维细胞转染3种NPs (ANP、BNP和CNP)的过表达腺病毒，发现3种NPs可激活细胞内cGMP/PKG通路，上调TGIF1的表达水平，但对TGF-β1的表达水平无明显影响。研究人员同样给予心肌成纤维细胞cGMP/PKG通路的激活剂和抑制剂处理，发现PKG的激活主要通过上调TGIF1的表达水平抑制TGF-β1/Smad通路的激活。

综上所述，该研究发现DCM状态下心脏NPRC表达水平显著升高。NPRC基因敲除可减轻DCM小鼠的心肌纤维化，改善左室病理性重构和心功能，延缓DCM的进展，其分子机制为NPRC基因敲除可激活cAMP/PKA和cGMP/PKG通路，上调细胞内TGIF1的表达，降低TGF-β1的水平，抑制TGF-β1/Smad通路的激活，从而抑制心肌成纤维细胞的胶原合成和增殖。上述发现可能为DCM提供新的预防和治疗靶点。

该论文的第一作者是山东大学齐鲁医院心内科博士后孟霖霖，山东大学齐鲁医院心内科张澄教授和张运院士为该论文的共同通讯作者。山东大学齐鲁医院为第一和通讯作者单位。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add4222