国自然初审结果即将放榜?! Redox Biology：如何结合多个国自然热点，解决实际的疾病问题？

时间过得飞快，从3月20日国自然集中受理截止之后，眨眼来到了初审结果即将宫公布的时间，相信不少人已经紧张起来了。

随着国自然越来越“卷”，不少科研人不再集中于某个单一的热点，而会结合多个话题来进行探索和创新，实现1+1+1>3的局面。那么，到底该如何集合多个“国自然热点”，斩获高分文章呢？

今天，小编将为大家介绍“巨噬细胞分化+炎症+铁死亡”三大国自然热点的集合，为大家提供科研思路！

巨噬细胞是参与类风湿关节炎（RA）病情发展的主要免疫细胞之一。既往研究多集中于其分化异常对关节炎症和骨质破坏的影响，但巨噬细胞存活异常在RA进展中的作用仍不清晰。

中山大学潘云峰等人在Redox Biology杂志发表相关研究，首次明确了巨噬细胞为类风湿关节炎关节病灶铁死亡的主要靶细胞，探明M1和M2巨噬细胞的异质性铁死亡是介导病灶免疫紊乱的新机制，这一发现为RA相关炎症、免疫失衡提供了新的干预靶点。

一、研究内容与思路

1、RA病人和小鼠中存在铁聚集与铁死亡

作者检测了RA患者血清、滑膜与正常人血清的游离铁含量，发现RA患者滑膜铁含量高于RA和正常人血清铁含量，进一步分析临床指标发现铁含量对RA进展存在显著影响。在RA滑膜单核细胞/巨噬细胞中，作者观察到脂质过氧化（铁死亡标志物）。

进一步发现，当健康的白细胞暴露于RA滑膜液时，单核细胞显示出更高水平的脂质过氧化，而这可以通过铁螯合剂减轻。透射电子显微镜发现RA滑膜出现典型的铁死亡线粒体变化。自发性关节炎小鼠关节中存在铁沉积、脂质过氧化。

综上所述，这些发现共同暗示了铁死亡可能在关节炎的发病机制中发挥重要作用，特别是在RA中。

研究思路1：RA发病部位主要在滑膜，作者首先检测了RA患者滑膜、血清和正常人血清中的铁含量，发现RA滑膜铁含量增加，通过进一步分析，定位到单核细胞/巨噬细胞。采用多种实验证明，RA滑膜中出现典型铁死亡症状，表明铁死亡在关节炎中发挥重要作用。

2、抑制铁死亡可明显缓解关节炎炎症

作者给予铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（LPX-1）治疗K/BxN血清转移诱导关节炎（STIA）小鼠模型，发现LPX-1显著减轻了关节肿胀，并降低了关节炎评分，滑膜增生和炎症减少，且病理评分也减少。此外，LPX-1治疗降低了铁死亡指标MDA的水平，而提高了抗氧化剂GSH的水平。

进一步的分析表明，LPX-1主要通过调节关节炎环境而非全身性炎症过程，降低了炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，同时增加了抗炎因子IL-10的水平。这些数据确认了铁死亡在关节炎的病理过程中的重要作用。

研究思路2：作者构建了RA小鼠模型（K/BxN血清转移诱导关节炎小鼠模型），给与铁死亡抑制剂LPX-1后检测各个指标来探讨LPX-1对K/BxN STIA小鼠的改善作用，以及铁死亡指标。结果证明，抑制铁死亡可以改善RA。

3、LPX-1抗铁死亡作用取决于关节炎小鼠巨噬细胞

作者采用流式细胞术鉴定了关节炎铁死亡的细胞类型，发现巨噬细胞和中性粒细胞的比例有所增加。进一步研究发现抗铁死亡药物LPX-1抑制了中性粒细胞，增加了巨噬细胞的比例。因此，作者将研究重点集中在巨噬细胞。

采用clordonate（CL）清除小鼠巨噬细胞，之后造模，结果发现与空白脂质体（EL）相比，CL能够在给药后24小时内有效清除关节组织中的巨噬细胞。在STIA诱导期间，巨噬细胞的清除显著降低了关节炎疾病评分，表明巨噬细胞的重要性。但对巨噬细胞清除小鼠进行LPX-1治疗未能进一步降低关节炎评分，关节肿胀也无显著变化。此外，当巨噬细胞被清除后，LPX-1减轻炎症和滑膜增生效果消失，对MDA和GSH的影响也消失了。综上所述，关节炎中铁死亡主要依赖于巨噬细胞。

研究思路3：作者明确了铁死亡对RA的重要性后，之前又发现单核细胞/巨噬细胞中铁含量增加。对此，作者开展进一步验证，最终发现关节炎小鼠巨噬细胞铁死亡增加。构建脂质体清除巨噬细胞后发现，关节炎炎症得到改善，且LPX-1抑制关节炎炎症效果消失，表明LPX-1是通过巨噬细胞发挥作用的。

4、M1/M2亚群的异质性铁死亡易感性导致关节炎炎症环境

采用FeSO4模拟亚铁离子的病理刺激进行体外实验，发现亚铁离子的添加导致了巨噬细胞死亡，伴随着细胞活力下降和LDH释放增加。电子显微镜观察发现细胞死亡具有铁死亡的典型特征，包括线粒体收缩、膜密度增加和线粒体嵴的消失。

此外，作者还发现不同亚型的巨噬细胞对铁死亡具有差异的敏感性。CD206+巨噬细胞在亚铁离子刺激下显著减少，而CD16/32+巨噬细胞没有明显变化。

进一步探讨单核细胞在铁超载环境下的反应，发现铁超载会让单核细胞朝着M1巨噬细胞分化而非M2巨噬细胞，从而影响了M1/M2平衡。

研究思路4：体内实验明确了巨噬细胞的重要性后，开展体外实验来探讨铁死亡对于巨噬细胞分化的影响。

5、铁超载激活GPX4的自噬降解促进巨噬细胞铁死亡 

铁超载会使得细胞内铁含量增加，对此，作者检测了铁超载后巨噬细胞的亚铁含量，发现刺激1h后，细胞内亚铁增加，然后迅速降至低于对照组水平，这与细胞脂质过氧化的持续增加并最终导致细胞死亡的趋势不符。检测后发现铁吸收蛋白TFRC不断减少，而铁螯合蛋白FTH1和FTL显著增加，但与铁排泄相关的蛋白FPN1无明显改变。这些结果表明，细胞内铁可能不是巨噬细胞铁死亡的主要驱动因素。

铁死亡是一个涉及多种细胞机制的调控性细胞死亡过程，包括铁运输、谷氨酰胺合成、抗氧化反应和脂质代谢。对此，作者发现铁超载情况下，SLC7A11无变化，但GPX4的表达减少，此外，通过使用蛋白质合成抑制剂发现铁超载可能通过自噬-溶酶体途径导致GPX4的降解。

研究思路5：开展体外实验来探讨铁含量增加如何让巨噬细胞发生铁死亡，明确其作用机制。

6、p62/SQSTM1相关自噬作用对GPX4的不同降解决定了M1/M2亚型对铁死亡的不同敏感性

作者进一步发现，在铁超载条件下，巨噬细胞出现自噬。在GPX4减少同时，铁超载导致LC3-II水平升高，而p62/SQSTM1显著减少，表明自噬通路被激活。进一步发现M1和M2巨噬细胞对铁死亡表现出不同的敏感性——在铁超载环境下，M2巨噬细胞GPX4表达降低，p62/SQSTM1相关的自噬被激活，而M1巨噬细胞对铁的反应较弱，自噬抑制剂逆转了M2巨噬细胞的铁死亡。综上所述，GPX4自噬降解在M1和M2巨噬细胞不同的铁死亡结果中起着重要作用。

研究思路6：之前明确了铁死亡会对巨噬细胞分化产生影响，后续又发现铁超载可能通过自噬-溶酶体途径导致GPX4的降解。对此，作者开展了实验验证，探讨GPX4自噬降解在这一环节的重要性，具体明确到对M1或M2巨噬细胞的作用。 

小结

整体实验流畅完整，将炎症、巨噬细胞与铁死亡结合起来，最后浅浅联系自噬，巧妙的融合了国自然热点。

首先，作者通过临床样本发现RA患者滑膜铁含量增加，脂质过氧化水平升高，其中单核/巨噬细胞最为显著。之后，开展了体内实验，证明抑制铁死亡可以改善RA，明确到细胞类型，发现巨噬细胞的重要性。考虑到巨噬细胞存在不同亚型，开展体外研究发现抗炎型巨噬细胞M2比促炎型巨噬细胞M1对铁超载诱导的铁死亡更敏感。最后，探讨其机制，与两种细胞亚型在铁超载情况下呈现的异质性P62/SQSTM1-GPX4自噬降解有关。

参考文献：

[1] Liu Y, Luo X, Chen Y, et al. Heterogeneous ferroptosis susceptibility of macrophages caused by focal iron overload exacerbates rheumatoid arthritis. Redox Biol. 2024;69:103008. doi:10.1016/j.redox.2023.103008