【综述】膜联蛋白A1在脑缺血-再灌注损伤中作用的研究进展

摘要:脑缺血-再灌注损伤是急性缺血性卒中血管再通治疗过程中继发且不可避免的病理生理变化,可导致神经元受损,影响认知功能和行为功能,甚至发生死亡｡炎症反应是导致脑缺血-再灌注损伤的重要机制之一｡膜联蛋白A1是一种强大的生理性抗炎症蛋白质,作者对近年来膜联蛋白A1与脑缺血-再灌注损伤的关系进行综述,以期为后续研究提供参考｡

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,  AIS)包括两个相关的病理损伤过程,即原发性缺血引起的脑损伤和继发性缺血-再灌注(ischemia - reperfusio ninjury, I/R)损伤｡在AIS早期,I/R损伤会引起梗死区炎症级联效应,包括氧化应激､炎症细胞浸润和毒性炎症介质释放等,从而进一步导致神经组织损伤和细胞死亡｡近年来,膜联蛋白(annexin, ANX)A1在脑I/R损伤中的调控作用逐渐成为研究热点｡笔者在脑I/R损伤背景下,将ANXA1对小胶质细胞､神经元和血小板3种不同细胞的调控作用进行综述｡

1 ANXA1的结构和功能

ANX是一类具有相似结构和功能特点的钙依赖型磷脂蛋白超家族,根据来源动物的不同被分为A~E,来源于脊椎动物细胞内的ANX被命名为ANXA,目前已被发现的有ANXA1~ANXA11和ANXA13｡ANX家族是细胞内重要的信号蛋白,在细胞内外信号转导､调节炎症反应和细胞凋亡等方面发挥重要作用｡ANXA1最早被发现,其核心区域含有四个重复的“2型”钙结合域基团和一个N端结构域｡当细胞质中的ANXA1与钙离子结合后,钙结合域基团发生构象改变并向细胞膜转移,ANXA1的核心区域与细胞膜磷脂结合,从而暴露N端结构域｡暴露的N端结构域是ANXA1的主要功能结构域,主要通过与甲酰基肽受体(formyl peptide receptor, FPR)2结合发挥强大的抗炎症反应和促进溶解的作用｡ANXA1在脑､心､血管等器官和组织的细胞质中皆有表达,主要存在于单核细胞､嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等先天免疫细胞中｡Nie等对AIS急性期大鼠脑组织缺血半暗带内与炎症反应相关的基因表达模式进行探讨,通过DAVID､Metascape软件对比基因表达综合(gene expression omnibus, GEO)数据库内大脑中动脉闭塞-再灌注(middle cerebral artery occlusion - reperfusion, MCAO/R)大鼠模型的两个相关数据集,分别为经MCAO/R处理7d的GSE61616和经MCAO/R处理24h的GSE97537,最终自170个差异表达基因中筛选出7个与神经系统炎症反应高度相关的枢纽基因,其中包括ANXA1,通过TargetScan分析显示,脑I/R损伤急性期炎症反应中的微RNA-340-5p对ANXA1可能具有负调控作用｡为了验证微RNA-340-5p与ANXA1的关系,该研究进一步构建了大鼠MCAO/R模型,按每组6只完全随机分为假手术组和MCAO/R组,结果显示,MCAO/R组大鼠微RNA-340-5p在24h内迅速下降(P<0.01),ANXA1表达显著增加(P<0.01);与24h比较,MCAO/R组ANXA1的微RNA表达在9d内持续增加(P<0.01),仅在第7天时略下降,提示ANXA1可能参与了AIS后复杂的炎症反应过程｡但该实验研究未对微RNA-340-5p与ANXA1表达的关系进行深入探讨｡

2 ANXA1在小胶质细胞M2表型转化中的作用

小胶质细胞是一种免疫细胞,约占脑细胞总数的10%｡既往研究表明,小胶质细胞在AIS后的炎症反应过程中具有双重特性,即梗死区受损神经元释放大量损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)因子使小胶质细胞被激活,并促使其浸润至梗死区域,参与炎症反应的小胶质细胞可向促炎表型M1型细胞或向抗炎表型M2型细胞转化,两种表型之间存在动态变化｡AIS早期,梗死区小胶质细胞以向M1表型转化为主,M1型小胶质细胞分泌促炎性细胞因子[白细胞介素(IL)1､肿瘤坏死因子(TNF)α等]和活性氧,以引起强烈的促炎反应｡AIS发生后7~14d,小胶质细胞向缺血半暗带积聚,以向M2表型转化为主,表达高水平的抗炎细胞因子(甘露糖受体､IL-8和转化生长因子β1),并吞噬､清除因缺血缺氧和炎症损伤而退化的神经元以及死亡裂解产生的细胞碎片,即在向M2表型转化的小胶质细胞参与损伤组织的愈合修复｡因此,调控梗死区小胶质细胞的表型转化可能有助于治疗脑I/R后的炎症损伤｡

有研究指出,根据ANXA1的N端结构域人工合成的模拟肽Ac2-26,与ANXA1有相似的生物学效应,其可激活小胶质细胞FPR2,促使小胶质细胞向M2表型转化,从而发挥小胶质细胞的抗炎症反应及神经保护作用｡为探讨ANXA1调节I/R后小胶质细胞或巨噬细胞极化的具体机制,Xu等对23例成功接受血管内治疗的急性前循环大血管闭塞患者进行回顾性分析,平均年龄(68.96±9.76)岁,男性比例为56.52%｡按照血管内治疗后3个月改良Rankin量表(mRS)评分>2分为预后不良､mRS评分≤2分为预后良好,将23例患者分为预后不良组(12例)､预后良好组(11例),并纳入12名健康人作为对照组[男性占比6/12,平均年龄(63.83±13.13)岁]｡以入院时和血管内治疗后2~3d为观察时点,对比分析3组血浆ANXA1水平,结果显示,入院时急性前循环大血管闭塞患者血浆ANXA1水平低于对照组(P<0.01),血管内治疗术后2~3dANXA1水平与对照组相似(P>0.05),且预后良好组血浆ANXA1水平高于预后不良组(P<0.01)｡该研究对雄性C57BL/6J小鼠假手术组与MCAO/R组ANXA1水平的对比分析结果显示,MCAO/R组小鼠血浆ANXA1水平逐渐降低(MCAO后6､12h,均P<0.01),在模型建立后24h达最低点(P<0.05),模型建立后72h升高且高于假手术组水平(P>0.05);MCAO/R组小鼠脑梗死周围皮质中ANXA1表达降低,模型建立后6h达最低(P<0.01),随后逐渐升高(均P<0.01),72h达对照组水平(P>0.05)｡该研究进一步将48只MCAO/R小鼠完全随机分为静脉输注Ac2-26组[4mg/(kg·d)]和对照组(输注等量等渗盐水),干预3d时与对照组比较,静脉输注Ac2-26组MCAO/R小鼠神经功能评分改善,脑梗死体积缩小,皮质血流增加(均P<0.05)｡该研究将72只MCAO/R小鼠完全随机分为Ac2-26治疗组､Ac2-26+WRW4(2.2mg/kg)治疗组和溶媒(Vehicle)对照组,并在干预后第1､3天进行评估,以探讨Ac2-26是否通过FPR2发挥上述保护作用｡结果显示,与溶媒对照组比较,Ac2-26治疗组M2型小胶质细胞数量增加,促炎性细胞因子IL-1β受到抑制,抗炎细胞因子IL-10的分泌增加,血-脑屏障损伤减轻,神经元凋亡减少,提示Ac2-26可促进单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)α的磷酸化且抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的磷酸化,但该过程可能被FPR2特异性拮抗剂WRW4阻断(均P<0.05)｡为了排除小鼠模型混杂因素的影响,该研究进行了体外小鼠细胞的氧糖剥夺-再灌注(oxygen - glucose deprivation/ reoxygenation, OGD/ R)实验｡将小鼠的BV2小胶质细胞和HT22海马神经培养基按Vehicle､Ac2-26(1μmol/L)､Ac2-26(5μmol/L)和Ac2-26(5μmol/L) + WRW4干预后分别观察,得到了与体内实验类似的结果,即Ac2-26诱导的小胶质细胞向M2表型转化位移,且以剂量依赖性方式增强了AMPK-α的磷酸化和对mTOR的抑制,这些作用均被WRW4逆转(均P<0.01)｡AMPK/mTOR通路在自噬调节中的作用已被Ding等研究证实,因此,ANXA1FPR系统可能通过激活AMPK/mTOR/自噬信号通路发挥其功能,但仍需在未来的研究中进一步确定自噬相关分子｡

总之,通过外源性ANXA1模拟肽Ac2-26激活FPR2可以有效促进小胶质细胞向M2表型转化,但未来仍需进一步的实验研究来验证Ac2-26激活小胶质细胞FPR2发挥表型转化作用的具体信号通路｡

ANXA1还可通过蛋白质翻译后修饰途径促进小胶质细胞向M2表型转化,翻译后修饰是指通过在特定的氨基酸残基上添加或移除特定基团,从而改变蛋白质的功能､活性､定位和表达的调控方式,该调控方式包括磷酸化､乙酰化､琥珀酰化､小泛素相关修饰蛋白质(small ubiquitin-related modifier protein, SUMO)化修饰和糖基化等｡Li等对ANXA1 SUMO化修饰在缺血性脑血管病炎症反应中的具体机制进行探讨,将ANXA1以及SUMO1､SUMO2､SUMO3转染至人胚肾细胞(HEK293T),结果提示,ANXA1主要通过SUMO2在K113､K161和K257位点发生了SUMO化修饰｡为了解ANXA1SUMO化修饰的生物学意义,该研究应用带有野生型ANXA1､ANXA1-3KR(SUMO化修饰缺陷型)和ANXA1-SUMO2(SUMO化修饰模拟型)的腺病毒载体分别感染来自新生C57BL/6小鼠脑组织的原代小胶质细胞,将小胶质细胞分为OGD/R组和未处理组,复氧24h后结果显示,SUMO2小胶质细胞抗炎表型标志基因(精氨酸酶-1)以及抗炎细胞因子(IL-4､IL-10和转化生长因子β)表达增加(P<0.01);经自噬抑制剂(氯喹､氯化铵等)和激动剂(雷帕霉素)处理24h后显示,SUMO化修饰的ANXA1通过选择性自噬介导使kappaB抑制蛋白激酶α大量降解,从而抑制核因子κB(nuclear factor kappa B, NF - κB)信号通路的激活,进而促进小胶质细胞向抗炎表型转化｡该研究又参照细胞实验的方法,应用腺病毒载体分别感染小鼠4周后行MCAO/R处理,再灌注24h后显示,对小胶质细胞内ANXA1进行SUMO化修饰可减少脑梗死面积(P<0.01),并可改善脑I/R损伤小鼠的学习､记忆和运动功能(均P<0.05)｡该研究结果证明,SUMO化修饰的ANXA1作为负调节因子发挥作用,将kappaB抑制蛋白激酶α引导至自噬体进行清除,从而对脑I/R损伤诱导的NF-κB过度活化发挥抑制作用｡NF -κB是调节多种促炎性细胞因子表达的关键信号通路,可直接作为促炎性细胞因子IL-1β､IL-6､TNF-α等的转录因子,是小胶质细胞促炎与抗炎表型平衡转换的关键｡Mao等对SUMO特异性蛋白酶6(SUMO specific protease6, SENP6)在缺血性脑损伤后小胶质细胞极化和神经系统炎症反应中的作用进行研究,原代小胶质细胞培养基经OGD/R处理24h显示,与空白对照组比较,SENP6水平及其相应的微RNA水平明显升高(P<0.01);SENP6通过降低SUMO水平使ANXA1与kappa B抑制蛋白激酶α和自噬受体NBR1(neighbor of BRCA1)的相互作用受到抑制,进而阻止了kappa B抑制蛋白激酶α的降解;应用腺病毒载体敲低SENP6基因可抑制小胶质细胞向促炎表型转化,从而减轻了OGD/R诱导的神经元损伤,减少了促炎性细胞因子的分泌,使抗炎细胞因子的分泌增加｡该研究的动物实验部分应用重组腺病毒载体先敲低小鼠脑组织特定区域的SENP6,再经MCAO/R处理,结果显示,敲低SENP6可减少脑梗死面积(P<0.01),改善神经功能评分以及小鼠运动和认知功能(均P<0.05)｡因此,抑制SENP6的表达可以促进ANXA1的SUMO化修饰,这可能是调控ANXA1类泛素化修饰的又一方式｡总之,对ANXA1的翻译后修饰调节也可促进小胶质细胞向抗炎M2表型转化｡

3 ANXA1核易位对I/R后神经元凋亡的影响

既往研究表明,脑I/R可触发内源性和外源性凋亡途径,从而导致缺血半暗带中神经元凋亡,其中内源性凋亡途径包括线粒体释放的细胞色素C和激活相关Caspase-3,外源性凋亡途径则通过激活细胞表面死亡受体进一步激活Caspase-8｡对神经元凋亡机制进行研究有利于挽救神经元,改善AIS患者的预后｡研究表明,AIS可增加神经元细胞质内ANXA1向细胞核易位,以激活神经元凋亡通路,而使神经元凋亡｡在AIS导致的缺血缺氧环境下,细胞质内ANXA1通过ANXA1上的核易位信号(nuclear translocation signal, NTS)与细胞质内输入蛋白β结合,使ANXA1在细胞核内积累,细胞核内ANXA1可使p53转录增加,并进一步增强诱导促凋亡基因Bid的表达,从而激活Caspase-3内源性凋亡通路,引起神经元凋亡｡Xia等为探讨重组腺病毒载体(Ad-S100A11)抑制ANXA1核易位防止脑缺血诱导神经元凋亡的具体机制,将40只C57BL/6J雄性小鼠完全随机分为两组,并分别注射Ad-S100A11和携带绿色荧光蛋白基因编码的腺病毒载体,注射处理72h后构建MCAO/R模型,模型建立后24h结果显示,Ad-S100A11处理组小鼠神经元死亡减少,认知和运动功能显著改善(均P<0.05)｡进一步的体外实验将小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)和原代皮质神经元共同培养,按照正常对照组､过表达S100A11组､沉默S100A11组､ANXA1组和同时过表达S100A11-ANXA1组培养24h后构建OGD/R模型,结果显示,S100A11直接与ANXA1结合可抑制其与输入蛋白β相互作用,从而阻止ANXA1核易位,降低了Bid微RNA和凋亡相关蛋白的表达,过表达S100A11组细胞凋亡数减少(相对于正常对照组,均P<0.05),分析ANXA1核易位减少的原因可能与Ad-S100A11竞争性抑制输入蛋白β与ANXA1上的NTS序列结合有关｡Li等研究表明,反式激活蛋白(trans-activator,Tat)结构域结合NTS序列合成的细胞穿透肽Tat - NTS可阻断ANXA1与输入蛋白β的相互作用,从而抑制ANXA1核易位,可减少神经元凋亡(P<0.05);可减少MCAO/R模型小鼠脑梗死体积(P<0.01),降低神经功能缺损评分(P<0.05)｡Zhou等对Tat - NTS肽靶向小胶质细胞ANXA1防止缺血性脑损伤的潜在机制进行研究,将小胶质细胞经过OGD处理,并分别于OGD处理后2､4､6､8､10h注射细胞穿透肽Tat - NTS(20μmol/L),结果显示,OGD处理后2h细胞穿透肽Tat - NTS开始对ANXA1核易位产生影响(P<0.05),在OGD处理后6h达最大效果(P<0.01)｡该研究表明,在生理条件下,ANXA1主要定位于细胞质中(P<0.01);在OGD/R条件下,ANXA1的表达增加并转移至细胞核中(P<0.01);经细胞穿透肽Tat - NTS处理减少了ANXA1的核易位,并促使其在细胞质中SUMO化修饰(P<0.05),使小胶质细胞抗炎基因的表达增加(均P<0.05);细胞穿透肽Tat - NTS增加了ANXA1与SUMO2的相互作用;小鼠海马神经元经OGD处理后立即放入经过细胞穿透肽Tat - NTS处理的小胶质细胞培养基中共培养,显示缺血性神经元凋亡减少,神经元中的凋亡蛋白(Bid:P<0.01,Caspase-3:P<0.05)表达水平降低｡该研究在对MCAO小鼠模型的观察中得到了与上述实验步骤类似的结论,经细胞穿透肽Tat - NTS(20μmol/L)处理后,小鼠脑梗死面积较小(P<0.01)､神经功能缺损得分较低(P<0.05)｡该研究创新之处在于将ANXA1作用于小胶质细胞抗炎信号通路与神经元凋亡信号通路结合,提示ANXA1在炎症反应中对多个细胞的调节作用是相互交叉的｡

ANXA1的蛋白质翻译后修饰在神经元细胞核易位中发挥了重要作用｡Xia等在新生C57BL/6小鼠中提取大脑皮质神经元以制备初级培养神经元,并将其与人HEK293T和N2a细胞系按正常对照组､OGD/R处理组以及SENP6抑制组进行细胞实验,结果显示,OGD结束后,ANXA1的SUMO水平降低,SENP6表达增加(均P<0.01);SENP6介导的ANXA1去泛素化修饰增加,ANXA1核易位显著;复氧24h时,SENP6抑制组神经元凋亡减少,SENP6抑制组ANXA1去泛素化修饰减少,ANXA1核易位减少和p53活性降低(均P<0.01);Bid表达和Caspase-3激活受到抑制,神经元凋亡减少｡该研究同时在MCAO/R实验中,将小鼠分为MCAO模型组､假手术组以及SENP6抑制组,结果显示,SENP6抑制组小鼠脑梗死面积更小(P<0.01)且神经功能缺陷评分更低(P<0.05)｡因此,通过抑制AIS后神经元细胞质内上调的SENP6可以有效增强ANXA1的SUMO化修饰,减少ANXA1核易位｡

总之,通过阻断ANXA1上NTS结构域或干扰ANXA1的蛋白质翻译后修饰均可抑制神经元细胞质内ANXA1的核易位,可以阻断因缺血缺氧被激活的内源性Caspase-3凋亡通路,从而减少神经元凋亡｡

4 ANXA1在脑I/R损伤中的抗血小板聚集作用

既往研究认为,脑I/R损伤后炎症反应和血栓形成过程相互依存,由此产生了血栓性炎症的概念｡再灌注过程中出现的快速炎症反应导致随后的脑微血管功能障碍,血小板附着在缺血血管病变处,该过程增加了继发性血栓事件和进一步组织损伤的风险｡

Senchenkova等将C57BL/6小鼠分为野生型组和ANXA1基因敲除(ANXA1-/-)组,在MCAO模型建立60min后再灌注4､24h,基因敲除组小鼠在再灌注后的两个时间点均显示血小板与内皮的黏附性增加(均P<0.05)｡将MCAO过处理的野生型组小鼠分为等渗盐水对照组､全蛋白ANXA1处理(3.3mg/kg)组以及WRW4处理(1.8mg/kg)组,结果显示,注射全蛋白ANXA1可以激活血小板FPR2,以此降低梗死部位血管内血小板黏附和脑内皮上血小板-中性粒细胞聚集体的积累,且该过程可被WRW4阻断(均P<0.05);经ANXA1处理的小鼠血栓素B2水平有所下降,且血小板聚集凝血酶的速度减慢(均P<0.05),提示ANXA1可降低血栓形成的风险;再灌注24h给予小鼠ANXA1后显示,脑小静脉血流量增加了45.51%,脑小动脉血流量增加了58.09%(均P<0.05),提示ANXA1可防止血栓事件的发生｡为进一步探讨上述研究结果在人体内的情况,该研究纳入11例AIS患者,将分离出的血小板(1.0×106)与100ngANXA1预孵育37℃,30min,通过荧光素异硫氰酸酯标记血小板表面单克隆抗体(一种针对暴露在活化形式αⅡbβ3上的新表位点的特异性单克隆抗体)进行评估,结果显示,经凝血酶刺激,提高了血小板表面P选择素和活性αⅡbβ3的水平,而ANXA1仅抑制了活性整合素αⅡbβ3水平(均P<0.05),对P选择素未产生影响(P>0.05)｡ANXA1可通过抑制凝血酶诱导由内向外信号的激活,如蛋白激酶B激活､细胞内Ca2+释放等,从而抑制整合素αⅡbβ3的激活,降低血小板聚集及血栓形成的风险｡

上述研究通过采用分离人血小板并接受ANXA1的干预证明,ANXA1能够通过FPR2降低血小板聚集,协调血小板功能的平衡,使其在脑I/R损伤中由致病作用转变为调节作用｡

5 总结与展望

ANXA1作为一种强大的内源性抗炎症蛋白质,参与了脑I/R损伤相关的一系列炎症反应过程｡通过调控ANXA1可促使脑I/R损伤环境下小胶质细胞向抗炎表型M2型细胞转化,减少神经元凋亡以及抗血小板聚集以减少血栓形成及血小板参与的炎症反应过程｡然而,上述作用的具体机制仍需进一步深入研究阐明｡目前,对ANXA1的研究主要使用Ac2-26这一生物制剂,且大多停留在细胞和动物实验阶段,需要进一步的临床研究以证实其有效性及安全性｡另外,ANXA1在正常生理情况下即参与机体多器官､多系统､组织细胞的功能调节,在未来的研究中,需要注重ANXA1在多种细胞中的相互作用。