Nature子刊：单细胞技术鉴定对弥漫性大B细胞淋巴瘤有临床效果的CAR-T细胞亚群

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL) 是一种具有侵袭性且快速生长的B 细胞非霍奇金淋巴瘤，在儿童淋巴瘤患者中约占15%。儿童DLBCL患者在经过规范治疗后一般预后良好，约90%患者可获得临床治愈。但仍有少数患者会经历复发或对初始治疗缺少反应。

靶向CD19的CAR-T治疗已被证明在难治性B细胞谱系白血病和淋巴瘤患者的治疗中具有良好的效果，但由于肿瘤间与肿瘤内部的异质性，现有的技术在制备CAR-T细胞时无法准确捕获具有特定功能的T细胞群体，这可能对CAR-T治疗的抗肿瘤效果产生负面影响。如何基于分子特征筛选出具有最佳抗肿瘤效果的T细胞亚群仍有待探索。

近日，来自休斯顿大学的 Sattva Neelapu 及 Navin Varadarajan 团队在 Nature Cancer 发表题为 Identification of a clinically efficacious CAR T cell subset in diffuse large B cell lymphoma by dynamic multidimensional single-cell profiling 的论文，通过包括单细胞分析在内的多组学动态分析揭示了DLBCL患者的CD19特异性CAR-T细胞的异质性，同时整合细胞的功能、表型、转录谱和代谢，最终确定并验证了一个称为CD8-fit T细胞的T细胞亚群，该亚群与CAR-T治疗的临床效果密切相关。

本研究使用了来自16例接受了抗CD19 CAR-T细胞疗法的DLBCL患者的CAR-T细胞，在治疗后6个月的随访中，9例个体显示完全缓解(CR)，7例显示部分缓解(PR)或疾病进展(PD)。研究团队首先通过纳米孔网格的延时成像显微镜(TIMING)、三维共聚焦显微镜单细胞水平对样品细胞进行了检测。结果显示，CR个体的T细胞迁移速度、T细胞的线粒体和溶酶体体积显著高于PR或PD个体，无监督的层次聚类的结果则表明连续杀伤、迁移能力以及线粒体和溶酶体体积增加是与CR个体的T细胞相关的特征。

随后作者对来自4例CR个体与5例PD个体的7439个CD8⁺T细胞进行了单细胞RNA测序，通过PCA进行降维分析确定了7种CD8⁺T细胞簇，其中CD8-6簇主要来自CR患者。在该细胞簇中，包括细胞毒性、细胞因子、趋化因子和迁移在内的相关功能基因呈现高表达，同时与T细胞抗原受体(TCR)激活、PGC1α/线粒体生物发生、肌动蛋白细胞骨架调节和迁移相关的通路呈现显著富集。总的来说，CD8-6细胞表现出迁移、连续杀伤和线粒体适应性的特征，因此作者将其重新命名为CD8-fit T细胞。

图1:（a）7439个细胞样本的UMAP图（c）3个不同细胞簇的差异表达基因

由于CD8-fit T细胞具有更高的迁移能力，作者接下来在19-28z T细胞中对这一推论进行验证。首先使用AMPK抑制剂处理19-28z T细胞，处理后的T细胞呈现更低的迁移能力与肿瘤结合能力，证实AMPK在T细胞迁移中具有重要作用。随后作者筛选出迁移和不迁移的19-28z T细胞，并对这两组T细胞进行单细胞分析。ssGSEA结果表明，具有迁移能力的19-28z T细胞在CD8-fit T细胞、杀伤T细胞中富集程度更高。因此T细胞的迁移能够促进CD8-fit T细胞的富集。同时，作者通过TIMING分析证实了迁移的19-28z T细胞具有更好的抗肿瘤效应，这表明迁移能力是具有功能的T细胞亚群的必备特征。此外，作者在人B淋巴细胞白血病小鼠模型中观察到，杀伤性CAR-T细胞具有更强的迁移能力，使用其处理的小鼠体内肿瘤显著减灭且更为彻底。这表明迁移能力也与杀伤性T细胞的作用密切相关。综合以上结果，作者证实了迁移能力对CAR-T细胞功能的积极作用，也验证了CD8-fit T细胞更显著的抗肿瘤效应。

图2: （c）16158个19-28z T细胞样本的UMAP图 （d）4个细胞簇的差异表达基因 （e）ssGSEA结果

图3: （c）人B淋巴细胞白血病小鼠模型，彩色图像说明了ffLuc表达EGFP+ NALM-6细胞的光子通量 （d）来自三个独立小鼠队列的NALM-6衍生光子通量的纵向测量时间过程（每组10只小鼠）

综上，在本研究中，作者应用单细胞分析与视觉人工智能技术鉴定出了一种特殊的CD8 T细胞亚群，该细胞亚群在增强CAR-T治疗的抗肿瘤作用中可能具有潜在价值。