使用超临界流体色谱法制备手性分离羟氯喹

羟氯喹 (HCQ) 作为外消旋硫酸盐广泛用于治疗疟疾、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。过去 30 年也有大量报道称，当施用外消旋药物时，HCQ（及其近亲氯喹）的对映异构体代谢不同。据报道，在大鼠、兔和人类使用 HCQ 的外消旋体后，对映异构体的生物活性不同。然而，尚未报道每种对映异构体的影响，这可能是由于难以获得大量纯对映异构体的 HCQ。

为了优化药物的治疗价值，有必要确定一种对映异构体是否具有较低的治疗价值和/或显着的不良副作用。早期药物开发研究在很大程度上依赖于色谱技术，例如超临界流体色谱 (SFC)，以快速分离候选药物的立体异构体。这种技术被认为是可扩展的，以前没有应用于 HCQ 的分离。该药物目前作为消旋体用于多种治疗靶点。有充分证据表明，HCQ 在人体中经历了广泛的新陈代谢，产生显着水平的三种手性代谢物，导致多达八种不同的化学实体，每一种都有自己的药代动力学和药效学特性。由于目前对药物再利用策略的兴趣，研究人员强调，关键的下一步是确定 HCQ 的 R 和 S 对映异构体的风险收益概况。

实验：

1.材料和化学品：二氧化碳（完全干燥级）购自 Praxair（Pittsburgh，PA，USA）。HPLC 级溶剂购自 EMD Chemicals（Gibbstown, NJ, USA），乙醇购自 Thermo Fisher Scientific（Allentown, PA, USA），二乙胺 (DEA) 购自 Sigma-Aldrich（St. Louis. MO ， 美国）。Enantiocel C2-5 制备柱 (3 × 25 cm) 购自 ColumnTek (State College, PA, USA)。

2. 仪器仪表：在配备双泵 (FCM-1200)、自动进样器 (ALS-3100)、柱温箱 (TCM-200) 和二极管阵列检测器 (DAD-4100) (Mettler-Toledo,美国特拉华州纽瓦克）。样品在配备两个 SD-1 Varian 泵的 Berger Multigram II SFC、设置在 220 nm 的 Knauer K-2501 分光光度计、带有内置冷却器和加热器的 6 吨散装 CO2 罐以及 G700 压缩机（Mettler -托莱多，纽瓦克，DE，美国）。在 JASCO P1010 旋光仪上进行旋光。

3. 制备型 SFC 分离：将硫酸羟氯喹(1.03 g，2.35 mmol)溶解在20 mL水和2 mL二乙胺中。水层用二氯甲烷(3×15mL)洗涤。合并的有机层用MgSO 4 干燥并真空浓缩，得到浅黄色油状物(732mg，2.18mmol，92％产率)。样品在 ColumnTek Enantiocel C2-5 (3 × 25 cm) 纤维素衍生色谱柱上分离，使用 40% 甲醇 (0.1% DEA)/CO2，流速为 80 mL/min，检测波长为 220 nm。在 3 分钟间隔内注射和收集总共 380 mg/3 mL。

4. 绝对配置分配：游离碱的旋光度 peak-1[α] 22 D  = +114.8° ( c  = 0.73, MeOH), peak-2 [α] 22 D  = -93.5° ( c  = 0.93, MeOH)。通过 SFC 分析 S(+) HCQ 和 R(-) HCQ 的样品标准，并确认峰 1 是“S”对映异构体，峰 2 是“R”对映异构体。

在 Enantiocel C2-5 色谱柱 (0.46 × 25 cm) 上使用 40% 甲醇 (0.1% DEA)/CO2，流速为 4 mL/min 并在 220 nm 处检测得到 HCQ 对映异构体的分析 SFC 色谱图：

在 Enantiocel C2-5 色谱柱 (3 × 25 cm) 上使用 40% 甲醇 (0.1% DEA)/CO2 以 80 mL/min 的流速分离 1 g HCQ 的对映异构体并进行检测的制备型 SFC 色谱图在 220 纳米：

在 Enantiocel C2-5 色谱柱 (0.46 × 25 cm) 上，使用 40% 甲醇 (0.1% DEA)/CO2，流速为 4 mL/min，检测波长为 220 nm，收集的 HCQ 每种对映异构体的组合馏分的分析 SFC 色谱图：

综上所述，开发了一种使用 Enantiocel C2-5 色谱柱的稳健超临界色谱 (SFC) 方法，用于对羟氯喹 (HCQ) 的对映异构体进行多克分离，证实了其作为一种可扩展技术的用途，并且能够为临床评估提供每种对映异构体的数量。HCQ 的对映异构体按克级收集，对映异构体过量超过 99%。S 和 R 对映体洗脱顺序通过旋光度测定与先前确定的分配进行比较来确认。

参考文献：Wilson LJ, Mi C, Kraml CM. A preparative chiral separation of hydroxychloroquine using supercritical fluid chromatography. J Chromatogr A. 2020 Dec 20;1634:461661. doi: 10.1016/j.chroma.2020.461661. Epub 2020 Oct 29. PMID: 33166894; PMCID: PMC7598365.