JIC：WT1-TCR-T细胞： 儿童复发性AML的潜在疗法

急性髓系白血病（AML）是一种源于髓系造血干细胞的恶性疾病。在健康人群中，骨髓中产生未成熟的造血干细胞，这些细胞会分化成髓系造血干细胞和淋巴系造血干细胞，髓系造血干细胞会进一步分化为原始粒细胞、原始巨核细胞和原红细胞，最终分化为单核细胞和粒细胞、红细胞和血小板。淋巴系造血干细胞会分化为淋巴细胞。

AML患者中，由髓系造血干细胞分化而来的原始粒细胞无法正常的分化为健康的白细胞，而是分化成一种未成熟的白细胞 （称为白血病细胞或髓样母细胞）。它们不能正常的分化，而是迅速的扩增，在血液和骨髓中积累，占据健康白细胞、红细胞和血小板的空间。这些白血病细胞也可以从血液中扩散到身体的其他部位，包括中枢神经系统（脑和脊髓）、皮肤和牙龈。AML的患者会呈现出贫血、凝血功能障碍等症状，并且频繁发生感染。儿童AML的发病率为百万分之七，目前生存率在50~80%。造血细胞移植（HCT）是儿童AML的治疗方式之一，但HCT后的复发仍然是死亡的主要原因之一，占到了接受HCT患者的30%。

据报道，WT1 （Wilms tumor1）在75~90%的AML病人中过表达，被认为是微小残留病灶 (MRD) 一个潜在的标志物。有研究利用靶向WT1的TCR-T细胞预防成人AML复发，显示出不错的疗效和安全性。

近期，来自荷兰乌得勒支 Dr. S Nierkens 团队在 Journal for ImmunoTherapy of Cancer 发表题为 Combining CRISPR-Cas9 and TCR exchange to generate a safe and efficient cord blood-derived T cell product for pediatric relapsed AML 的文章，在脐带血来源的T细胞上敲除内源TCR，过表达了WT1-TCR，并在体外水平进行验证，发现WT1-TCR-T cells对WT1阳性肿瘤细胞有杀伤能力，但对正常细胞没有毒性，揭示WT1-TCR-T cells是预防HCT后复发的潜在治疗方式。

首先，该文章通过CRISPR/Cas9系统敲除内源TCR，接着通过慢病毒转导的方式整合W1-TCR的α chain和β chain，使得CD8⁺ T细胞成功表达WT1-TCR，最终产生eTCR^-/-  WT1-TCR-T cells（图1）。

图1. eTCR^-/- WT1-TCR-T cells 生产流程图

接着，作者对比了eTCR^-/- WT1-TCR and eTCR^+/+  WT1-TCR T cell的免疫学表型。它们具有相似的CD45RA和CD62L细胞分群，有相似memory marker表达。其次，激活marker和抑制marker表达类似，只有CD127在eTCR^-/- WT1-TCR表达稍高。当TCR-T与表达WT1 peptide的T2细胞共培养时，eTCR^-/- WT1-TCR中有更多的CD137阳性细胞，说明激活水平更高（但不具有统计学差异），而且eTCR^-/-  WT1-TCR T有更高的毒性，分泌更高水平的TNFα，IFNγ ， granzyme A 和granzyme B。

图2. eTCR^+/+  WT1-TCR和eTCR^-/-  WT1-TCR的免疫表型和激活能力对比

为了测试在自然条件下eTCR^-/-  WT1-TCR-T的杀伤效力，文章在基因修饰过的K562 和两株AML-derived 细胞系（PER-484和PER703）上进行验证。这些细胞系都表达HLA-A2和WT1。将TCR-T和这些细胞系共培养后发现，eTCR^-/-  WT1-TCR-T的CD137和表达都高于eTCR^+/+ WT1-TCR T 细胞。

图3. eTCR^-/- WT1-TCR-T cells和eTCR^+/+  WT1-TCR T cells的细胞毒性对比

为了进一步验证TCR-T的效果，作者利用骨髓微环境的3D模型验证eTCR^-/-  WT1-TCR-T cells对儿童复发AML细胞的杀伤效果。和对照组比，被eTCR^-/-  WT1-TCR-T cells处理过的肿瘤细胞数量仅剩20%~70% 。而且，eTCR^-/-  WT1-TCR-T cells有向肿瘤细胞和基质更强的迁移能力。除此之外，和对照组一样，eTCR^-/-  WT1-TCR-T不杀伤基质细胞和脐带血来源的CD34⁺细胞，表明eTCR^-/-  WT1-TCR-Tcells能特异性杀伤WT1过表达的肿瘤细胞。

图4. 在儿童AML骨髓微环境3D模型中验证eTCR^-/-  WT1-TCR的细胞毒性

总之，本项研究利用WT1-TCR替代了脐带血来源的CD8 T细胞的内源TCR，并在体外对该TCR-T cells进行了有效性和安全性的验证，表明WT1-TCR-T cells是针对儿童复发性AML的潜在治疗方法。