NLRP3通过抑制cGAS-STING信号通路防治辐射诱导的结肠及皮肤损伤

原文出处
Wu T, Gao J, Liu W, et al. NLRP3 protects mice from radiation-induced colon and skin damage via attenuating cGAS-STING signaling. Toxicol Appl Pharmacol. 2021 May 1;418:115495. doi: 10.1016/j.taap.2021.115495.

研究背景
放射治疗目前是一种常用的治疗各种癌症的技术。放疗引起的组织损伤，包括胃肠道损伤，是肿瘤放疗患者常见的并发症。辐射诱导的肠炎在腹腔或盆腔肿瘤患者放疗期间经常发生。接受放疗的患者通常会出现短期的肠道炎症，并且多达15%的患者会出现慢性的肠道问题。包括水肿、红斑、色素沉着和坏死等放射性皮肤损伤，也是放疗所导致的常见后遗症。据估计，在接受放疗的患者中，大约85%的患者会出现中度至重度的皮肤损伤。由于这种副作用可能对放疗过程和患者的生活质量产生负面影响，因此，放射防护剂及治疗剂将起到至关重要的作用。包括改进的放疗技术以及天然抗氧化剂等预防和治疗策略目前正在开发。

电离辐射通过凋亡、自噬细胞死亡、有丝分裂突变、焦亡和细胞衰老等多种途径导致癌细胞死亡。电离辐射引发的活性氧（ROS）可破坏DNA、内质网和线粒体。放疗对正常组织和癌变组织，特别是细胞快速分裂的组织，如造血系统、血管内皮系统、黏膜系统，均会造成损伤。最近的研究表明，暴露于辐射也会导致免疫系统的激活和损伤，触发炎症细胞因子的产生，导致全身炎症状态。受损和死亡的细胞会释放许多分子，称为损伤相关分子模式（DAMPs），可被各种先天免疫受体所感知。由于辐射可以引起大量的非特异性损伤（在不同的组织和一些细胞器中，如细胞核DNA、内质网和线粒体）。DAMPs，包括但不限于ROS、dsDNA和线粒体DNA，已经被证明可以释放和激活一些先天免疫受体，包括AIM2炎性小体，NLRP3炎症小体和cGAS-STING信号通路。

NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和caspase-1组成，是一个多蛋白复合物，作为caspase-1激活的平台。NLRP3炎症小体可被多种应激源触发，包括病毒感染、晶体物质、代谢物和组织损伤等。大多数研究集中在NLRP3炎症小体的致病作用及其对许多疾病的发展的贡献，但其生理作用尚不清楚。一些研究已经证明了NLRP3炎症小体的益处，例如，低水平的IL-1β可以增加离体大鼠胰岛的胰岛素释放。研究表明NLRP3缺陷小鼠易对白色念珠菌感染过敏。在本研究中，作者研究了NLRP3在辐射诱导的小鼠组织损伤中的作用。结果显示NLRP3基因敲除导致了更严重的辐射诱导的结肠和皮肤损伤，最终导致小鼠死亡。机制研究表明，NLRP3缺失后cGAS-STING通路的过度激活导致小鼠辐射损伤加重（摘要图）。

研究结果
结果一、巨噬细胞NLRP3缺失加剧了辐射诱导的小鼠死亡和结肠病理改变
为了研究NLRP3在辐射诱导的结肠损伤中可能的作用，作者制作了巨噬细胞特异性NLRP3敲除小鼠（NLRP3 lyz−/−），并对其进行全腹部辐射。16 Gy辐射导致所有NLRP3lyz−/−小鼠在第6天死亡，但是20%的WT小鼠存活到第15天（p = 0.0055）（图1A）。14 Gy辐射剂量下，第15天WT小鼠的存活率为75%（9/12），NLRP3 lyz−/−小鼠的存活率为50%（6/12）（p = 0.11）（图1B）。这些数据表明巨噬细胞特异性敲除NLRP3导致全腹放疗后小鼠死亡率增加。接下来，作者检测了14 Gy辐射后WT和NLRP3 lyz−/−小鼠结肠的病理变化。经L-012成像分析的ROS结果显示，NLRP3 lyz−/−小鼠结肠中ROS生成水平高于WT小鼠（图1C）。处死动物后检查结肠，形态学和宏观评分显示NLRP3 lyz−/−小鼠结肠损伤更严重（图1D、E）。最后，通过H&E染色和组织学检查证实NLRP3 lyz−/−小鼠存在严重的结肠损伤（图1F）。

结果二、巨噬细胞NLRP3缺失加剧了受辐射小鼠肠上皮屏障的损伤
接下来，作者检测了肠上皮屏障功能。采用FITC-葡聚糖灌注法，检测紧密连接相关蛋白的表达情况。与对照组小鼠相比，辐射应激小鼠血清中FITC -葡聚糖水平更高，而NLRP3 lyz−/−小鼠血清中FITC-葡聚糖水平高于WT小鼠，表明结肠通透性增加（图2A）。通过免疫组化检测紧密连接蛋白ZO-1、钙粘附蛋白E（E-cadherin）、紧密连接蛋白claudin-2的表达情况。结果显示辐照后NLRP3 lyz−/−小鼠中ZO-1和E-cadherin的表达较WT小鼠下降较多（图2B、C），屏障功能降低。同时，NLRP3 lyz−/−小鼠中claudin-2的表达显著高于WT小鼠（图2D），表明结肠通透性增加。这些结果表明，NLRP3可以保护肠上皮屏障免受辐射损伤。

Fig. 1.NLPR3 knockout in macrophages aggravated radiation-induced mortality and colon damage in mice. (A) WT and NLRP3 knockout (NLRP3lyz−/−) mice were subjected to whole abdominal radiation at a cumulative radiation dose of 16 Gy and then the survival rates were monitored continuously (n =5). (B) WT and NLRP3lyz−/−mice were subjected to whole abdomen radiation at a cumulative radiation dose of 14 Gy and then the survival rates were monitored continuously (n =12). (C) ROS generation in colon was detected by the chemiluminescent probe L-012 at day 5. (D, E, F) WT and NLRP3lyz−/−mice were subjected to whole abdomen radiation at a cumulative radiation dose of 14 Gy. After sacrificed at day 7, colon was taken out and photographed (D), subjected for macroscopic damage scores (E) and H&E staining (F). Values were shown as the means ±SEM of six mice in D and E. *P <0.05, **P <0.01, vs. as indicated.

Fig. 2.NLRP3 knockout in macrophages deteriorated damage of the intestinal epithelial barrier function in radiation-treated mice. WT and NLRP3lyz−/−mice were subjected to whole abdominal radiation at a cumulative radiation dose of 14 Gy. (A) FITC-dextran analysis was done at day 7. (B, C, D, E) Colon tissue section taken at day 7 were subjected for immunohistochemistry of ZO-1, E-cadherin and Claudin-2. Scale bar: 100 μm.

结果三、NLRP3缺失导致cGAS-STING信号通路过度激活
为进一步探讨NLRP3对辐射所致结肠损伤的保护作用，作者分别在体内外检测了cGAS-STING信号通路的激活情况。辐射能够触发cGAS-STING激活，证据是辐射后WT小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）培养上清和血清培养上清中IFN-β水平均升高，并且NLRP3 lyz−/−小鼠BMDMs培养上清和血清培养上清中IFN-β水平也明显升高（图3A、B）。此外，与WT小鼠相比，NLRP3 lyz−/−小鼠的BMDMs中p-TBK-1和p-IRF3蛋白水平显著增加（cGAS-STING信号通路）（图3C）。在辐照后的WT和NLRP3 lyz−/−小鼠结肠组织中也观察到同样的趋势（图3D）。这些结果表明，NLRP3可能通过限制cGAS-STING通路活性发挥结肠保护作用。

Fig. 3.NLRP3 knockout led to hyperactivation of cGAS-STING pathway. (A) WT and NLRP3lyz−/−mice were subjected to whole abdominal radiation at a cumulative radiation dose of 14 Gy and serum were collected at day 7 and level of IFN-β were determined by ELISA. (B, C) BMDM taken from WT and NLRP3lyz−/−mice were irradiated at dose of 8 Gy and 24 h later cell culture supernatant was collected and subjected for IFN-β analysis by ELISA (B) and protein were collected for western blot analysis (C). (D) Colon tissue section taken at day 7 were subjected for immunohistochemistry of p-IRF3. Scale bar: 100 μm. Values were shown as the means ±SEM of six mice in A, D and triplicated experiments in B. *P <0.05, **P <0.01 vs. as indicated.

结果四、巨噬细胞NLRP3缺失会加剧辐射诱导的皮肤溃疡
在实验过程中，作者还观察到NLRP3 lyz−/−小鼠照射后皮肤反应加重。图4A显示NLRP3 lyz−/−辐照小鼠的皮肤溃疡最严重，这一点通过H&E染色进一步证实（图4B）。此外，NLRP3 lyz−/−小鼠的cGAS-STING通路的过度激活通过皮肤组织中p-IRF3的表达升高得到证实（图4C）。

Fig. 4.NLRP3 knockout deteriorated radiation-induced skin ulcers with hyperactivation of cGAS-STING pathway. (A) WT and NLRP3lyz−/−mice were subjected to whole abdominal radiation at a cumulative radiation dose of 14 Gy and animals were observed for skin ulcers for a period of 30 days. (B, C) Skin tissue section taken at day 30 were subjected for H&E stain (B) and immunohistochemistry of p-IRF3 (C). Scale bar: 100 μm.

研究结论
1、辐射后，结肠组织中p-TBK-1和p-IRF3的磷酸化增强以及血清中IFN-β水平的升高表明cGAS-STING信号的过度激活，NLRP3基因敲除导致了更严重的辐射诱导的结肠和皮肤损伤；
2、NLRP3可能通过抑制cGAS-STING信号通路来保护小鼠免受辐射诱导的组织损伤；
3、一方面，维持NLRP3炎症小体的活性可以保护组织免受辐射。另一方面，抑制NLRP3炎症小体的激活可能有助于提高肿瘤放疗的效果。

原文链接
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33741346/