Cancers：CAR-T和CAR-NK实体瘤靶向的策略

工程化过继细胞疗法（ACT）的出现改变了血液肿瘤的治疗格局，也为实体瘤的治疗带来了希望。然而，细胞疗法在实体瘤中的应用受到肿瘤迁移不良、渗透物理屏障和肿瘤主动抑制的影响。因此，将内源性或过继转移的淋巴细胞精确引导进入实体肿瘤肿块是实现最佳抗肿瘤效果的必要条件，同时也将提高患者的安全性。

传统疗法，包括化疗和放疗，已被证明可以刺激T细胞迁移到肿瘤中，以增强治疗效果，而放疗可以对远处转移产生远端效应。类似地，通过在肿瘤内注射病原体相关分子模式或溶瘤病毒，直接诱导肿瘤内的炎症事件，刺激肿瘤部位的全身和局部事件，以鼓励淋巴细胞迁移和抗原特异性抗肿瘤反应。此外，抗原识别本身是迁移的主要刺激因素。

迄今为止，人们已经进行了许多探索和尝试，出现了许多策略，这些策略可用于增强实体瘤免疫治疗中过继转移细胞（包括CAR-NK和CAR-T细胞）的迁移和渗透。

趋化因子及其受体

趋化因子是一种细胞因子，调节免疫细胞的迁移和运输。趋化梯度对于将效应细胞招募到炎症部位，包括肿瘤微环境（TME）至关重要。实体瘤的趋化因子表达由基质细胞、肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞分泌，以决定哪些免疫细胞被招募到TME，从而帮助或阻碍肿瘤生长。

多种趋化因子/趋化因子受体策略已用于免疫治疗性T细胞临床前研究，以促进CAR-T细胞靶向肿瘤，包括利用CXCR3、CXCR2、CCR5、CCR2和CCR3轴。目前还没有获得批准的癌症趋化因子免疫治疗策略，但多个研究显示其具有良好的临床潜力。

CXCR3

CXCR3轴是实体瘤免疫细胞募集的关键途径，CXCR3的配体包括CXCL9、CXCL10和CXCL11。激活后，CXCR3在效应器TH1极化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞上诱导并高表达，肿瘤中CXCR3配体的表达、血清CXCR3配体水平的升高以及T细胞上的CXCR3增强了T细胞的募集，并在一系列癌症中获得了积极的临床前结果。

溶瘤痘苗病毒在间皮瘤小鼠模型中对CXCL11的肿瘤局部表达成功地增加了内源性细胞毒性T淋巴细胞向肿瘤的转运，并诱导了系统性抗肿瘤免疫，突出了CXCR3轴对淋巴细胞迁移的重要性。此外，表观遗传调节剂（DNA甲基化和H3K27三甲基化抑制剂）的使用恢复了CXCL9和CXCL10的肿瘤表达，提高了卵巢癌小鼠模型中的CAR-T细胞效率，改善了T细胞浸润和肿瘤生长控制。在小鼠骨髓瘤模型中，将编码CXCL10和IL-18的两种溶瘤腺病毒联合注射到已建立的肿瘤中，可导致肿瘤生长变小，80%的小鼠肿瘤完全消退。

CXCR2

在一系列肿瘤模型中，T细胞上CXCR2表达的调节已被证明能提高治疗效果。CXCR2对多种肿瘤上过表达的配体具有特异性，包括CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8。这些配体也由各种浸润性免疫细胞表达，通常被认为是促肿瘤趋化因子。例如，CXCL8可直接促进侵袭和转移，并可通过招募粒细胞源性抑制细胞和中性粒细胞来促进促转移生态位。利用促肿瘤细胞因子表达的一种策略是在理想的效应细胞上异位表达其受体，如CXCR2，从而将其靶向肿瘤。

原代T细胞中CXCR2的表达增强了黑色素瘤小鼠模型肿瘤中T细胞的积累，改善了肿瘤的消退和存活。一项正在进行的I/II期试验旨在用CXCR2转导的肿瘤浸润淋巴细胞治疗转移性黑色素瘤患者，随后进行高剂量IL-2治疗，目前临床结果报告尚未公布（NCT01740557）。CXCR2表达在CAR-T细胞治疗中也显示出了应用前景。在肝细胞癌肿瘤模型中，CAR-T细胞上CXCR2的强制表达增加了肿瘤内的迁移和积聚，改善了治疗结果。类似地，CXCR1或CXCR2的异位表达增强了向肿瘤的转移，并在胶质母细胞瘤、胰腺癌和卵巢癌模型中诱导肿瘤消退并提高了生存率。

CCR4

受体CCR4在CD8+T细胞上低表达，其配体为CCL22和CCL17。在霍奇金淋巴瘤小鼠模型中，通过逆转录病毒转导抗CD30 CAR-T细胞增强CCR4的表达，增强了体外向淋巴瘤细胞的迁移，并提高了CAR-T细胞治疗的效果。尽管这项研究使用了血液癌症模型，但这种方法也可以应用于实体瘤，因为在胃肠道癌、卵巢癌和胰腺癌中发现了CCL22和/或CCL17表达上调。在胰腺癌小鼠模型中，用CCR4对抗原特异性细胞毒性T细胞进行逆转录病毒转导，增强了向肿瘤部位的迁移，并消除了40%小鼠的肿瘤。有趣的是，研究表明，CCR4修饰增强了与DC的相互作用，增强了T细胞LFA-1与DC ICAM-1的结合。因此，这种策略不仅有可能增强肿瘤的浸润，还可能增强肿瘤内部免疫细胞的激活和支持。

CCL2

CCL2由一系列肿瘤和支持肿瘤的免疫细胞分泌，并诱导促肿瘤免疫细胞（如巨噬细胞、TH2和调节性T细胞）的迁移。然而，其同源受体CCR2b仅在活化的T细胞上弱表达。与不表达CCR2b的CAR-T细胞相比，表达CCR2b的GDH-CAR-T细胞上向分泌CCL2的神经母细胞瘤的转运增强了10倍，并增加了相对抗肿瘤活性。然而，靶向CCL2途径可能会产生一些意外的毒性后果，因为CCL2在一系列非肿瘤细胞类型表达，包括内皮细胞、平滑肌和成纤维细胞，并且与多种疾病有关，例如类风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病和SARS-CoV-2感染。考虑到肿瘤产生的CCL2水平高于正常组织，CCR2b转导的CAR-T细胞尚需通过实验进行评估。

CXCR4

趋化因子受体CXCR4广泛表达于多种血液肿瘤和实体瘤。其与对应配体CXCL12（SDF1）的结合促进肿瘤细胞增殖、存活和转移。对CXCR4的抑制导致T细胞和NK细胞浸润增强，同时癌相关成纤维细胞（CAF）的募集减少。因此，抑制CXCR4是增强CAR-T和CAR-NK细胞向肿瘤部位浸润的潜在策略。

最近的研究表明，联合使用抗EGFRvIII CAR-T细胞和PARP抑制剂olaparib可提高疗效。olaparib可减少CAF分泌CXCL12，从而减少MDSC的迁移和浸润，提高乳腺癌小鼠模型中CAR-T细胞治疗的效果。

CCL5

CCL5由一系列趋化因子受体识别，这些受体表达在激活的T细胞上，如CCR1、CCR3和CCR5，使CCL5成为肿瘤特异性表达的良好候选，以促进过继转移的淋巴细胞迁移。CCL5武装的溶瘤病毒和CAR-T细胞疗法已成功用于神经母细胞瘤小鼠模型。

在NK细胞治疗的临床前小鼠模型中，利用CCL5轴也被证明能提高疗效。注入的NK细胞被设计为过表达CCR5，并在肿瘤内注射携带CCL5的痘苗病毒，导致NK细胞浸润增加和肿瘤消退。

尽管趋化因子的调节在免疫治疗模型中已显示出前景，但仍存在严重的应用问题，可能会限制其疗效。一个重要的考虑因素是，大多数趋化因子可能存在非特异性招募。例如，尽管CCL5可以通过招募T、NK和DC细胞等CCR5+细胞来增强抗肿瘤免疫反应，但它也可以招募单核细胞、巨噬细胞和调节性T细胞，并促进癌症侵袭。总之，需要明确所选趋化因子的作用，以防止抑制细胞意外招募到肿瘤中。

溶瘤病毒

溶瘤病毒（OV）具有重要的免疫调节作用，有可能与过继细胞治疗一起用于组合策略。OVs调节TME并影响宿主抗肿瘤免疫反应的能力为使用OVs靶向CAR-T细胞治疗肿瘤提供了强有力的理论依据。在机制上，OVs诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡，释放损伤和病原体相关的分子模式（DAMP和PAMP）、肿瘤相关抗原或新抗原，并在肿瘤部位诱导细胞因子和趋化因子表达。OVs可以在肿瘤细胞上诱导主要组织相容性复合体（MHC）的表达，从而增加抗原呈递。此外，OV介导的TME重塑影响先天性和适应性免疫细胞功能，增强树突状细胞激活、淋巴细胞浸润和激活，并刺激表位扩散。

除了OVs的自然免疫调节外，它们的基因修饰允许肿瘤局部表达广泛的多肽或非编码RNA，以进一步增强肿瘤的炎症特征，支持免疫细胞迁移和激活。在一系列临床前研究中，携带一系列细胞因子、趋化因子和双特异性T细胞接合器的OV已被用于重塑TME，并提高了CAR-T细胞治疗效果。TILT-123是一种携带TNF-α和IL-2的溶瘤腺病毒，具有与CAR-T细胞组合策略的潜力。在一系列临床前模型中与PD-L1抑制显示出令人信服的协同作用，TILT-123目前正在招募两个临床试验进行临床研究，作为单药或与肿瘤浸润淋巴细胞联合治疗转移性黑色素瘤（NCT04695327，NCT04217473）。

OV与CAR-T细胞疗法的另一种用途是利用转基因OV诱导肿瘤中的靶抗原表达。这一原理已在临床前研究中得到证实， CD19抗原通过OV载体展示在实体肿瘤细胞表面，从而通过抗CD19 CAR-T细胞疗法实现有效靶向。目前有两项I期临床试验（NCT01953900，NCT03740256），正在测试溶瘤病毒和CAR-T细胞治疗实体瘤的协同作用。

肿瘤诱导启动子

除了基因的组成性表达已被用于增强CAR-T细胞治疗外，还可以通过使用可诱导启动子系统特异性表达肿瘤的靶向性基因。通过肿瘤抗原触发炎症介质（包括趋化因子）的位点特异性释放是鼓励其他CAR-T细胞和旁观者细胞向肿瘤迁移的有用方式。

通过识别肿瘤抗原激活的可诱导启动子，无论是通过T细胞或TIL中的CAR或TCR，已被用于过表达多种基因，尤其是抗肿瘤细胞因子，并已被证明在提高安全性的同时增强了抗肿瘤效果。

IL-12已被证明能增强体内CAR-T细胞活性，但IL-12的毒性也很明显。靶向表达的临床前测试主要包括基于IL-2的NFAT启动子，将IL-12表达靶向肿瘤部位。使用这些抗原触发的启动子将IL-12表达固定在肿瘤部位，可提高体内CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用，并减少有效杀伤肿瘤所需的CAR-T细胞数量。该策略将IL-12表达观察到的全身毒性降至最低。CAR-T细胞局部表达IL-12也被证明能激活肿瘤部位的固有免疫细胞，如巨噬细胞，有助于消除抗原阴性的肿瘤细胞。

NFAT诱导启动子在非CAR-ACT中也显示出优势，例如TCR和TIL-ACT。与非工程化TIL相比，在肿瘤部位选择性表达IL-12的TIL产生了增强的抗肿瘤免疫反应，并且在转移性黑色素瘤的临床试验（NCT01236573）中所需剂量降低了10到100倍。虽然观察到了一些毒性，但它使用的诱导系统在人类治疗中展现出了应用潜力。

对于非TAA的信号作出反应的启动子的开发是另一个正在发展的研究领域，可以利用肿瘤代谢物特征的改变。有研究利用CMV启动子内的缺氧诱导元件开发了一种缺氧肿瘤微环境传感器。“HiTA系统”将CAR-T细胞基因表达限制在低氧环境中，而忽略了表达TAA的常氧组织。缺氧诱导表达系统也可用于表达其他转基因或CAR本身，以聚焦和增强免疫反应。

CAR结构的改造

CAR结构的选择和设计是优化迁移和抗肿瘤活性的关键考量因素。Dual CARs和Universal CARs（UniCAR）等系统是改善CAR-T细胞肿瘤靶向性和安全性的有效方法。

Dual CAR-T细胞表达针对不同抗原的CAR，可以在单个T细胞上表达一个以上的CAR或者用两组不同CAR结构转导的T细胞，以实现对多种抗原的靶向。这些方法已成功应用于一系列体内实体瘤的临床治疗，在临床试验中表现良好的结果。如通过体内靶向CD38和BCMA，组合两个独立的CAR-T细胞在临床已成功治疗多发性骨髓癌，客观缓解率达到87.5%，在随访近1年后，有76.9%的患者未出现复发转移。另外，针对CD19/CD22的双靶点CAR-T也进入临床试验（NCT03233854）。早期结果显示，88%的患者都能成功缓解，且全部完全缓解；21名LBCL患者中，62%的患者有反应，有29%的患者完全缓解。

UniCAR通过引入第二个组件，称为靶向模块（TM），为临床控制免疫反应创造了一个安全“开关”。TMs是UniCAR-T细胞靶抗原与TAA结合域（例如单链抗体）的融合蛋白分子，TMs将CAR与TAA连接起来，由于TM半衰期短（15–45分钟），去除TM可迅速消除UniCAR-T细胞活性。

目前，几个UniCAR系统已经进入临床试验阶段，几乎所有系统都专注于针对一系列靶点的血液恶性肿瘤，包括CD19（NCT02808442和NCT02746952）、CD22（NCT04150497）和CD123（NCT03190278）。虽然CD19试验在很大程度上取得了成功，67%的患者获得了完全缓解，但其他试验，如CD123 UniCAR试验（NCT04106076），遇到了安全问题。对于实体瘤，只有少数UniCAR临床试验注册，如一项针对前列腺癌中的PMSA的临床试验（NCT04633148）。

针对肿瘤微环境

癌相关成纤维细胞是一种表型异质性细胞群，可构建和重塑TME细胞外基质（ECM）。消耗或改变CAF的功能是目前一个深入研究的领域，有可能成为增强ACT和免疫疗法的一个有吸引力的选择。

由于CAF有助于ECM/细胞屏障，因此减少其数量和活性有可能与CAR-T/NK细胞治疗产生协同作用，以增加淋巴细胞向肿瘤的迁移。目前已经开发出几种CAR，它们通过靶向成纤维细胞活化蛋白α（FAP-α）直接消耗CAF发挥抗肿瘤作用。抗FAP-α CAR-T细胞治疗已在多种实体瘤的临床前模型中显示出令人信服的疗效。有两项利用抗FAP-α CAR-T细胞的临床试验，一项已完成的胸膜间皮瘤1期临床试验（NCT01722149）和一项利用第四代CAR的1期临床试验（NCT03932565）。

另一种不同的策略是去除免疫抑制细胞，如MDSC和TAM。在神经母细胞瘤小鼠模型中，去除肿瘤局部MDSC可提高CAR-T细胞的疗效和肿瘤浸润。通过使用抗叶酸受体β-CAR-T细胞清除TAM，发现内源性肿瘤特异性CD8+T细胞浸润增加。TAM靶向CAR-T细胞预处理增强了肿瘤特异性抗间皮素CAR-T细胞的疗效，使肿瘤消退并延长生存期。

此外，实体瘤通常表现出代谢紊乱，导致免疫抑制代谢物的释放，包括乳酸、腺苷和活性氧（ROS），这些代谢物可有效抑制淋巴细胞迁移。CAR-T/NK细胞治疗与肿瘤代谢抑制剂的联合可能增强它们向肿瘤的迁移和对肿瘤细胞的杀伤作用。

增强DC细胞活性

树突状细胞（DC）有助于T细胞室的稳态、激活和迁移潜能。在过继性T细胞转移的同时，使用刺激和增强内源性DC活性的策略将使T细胞参与和激活最大化，鼓励表位扩散，并以更有利于局部和全身免疫活动的方式改变TME。

Flt3L是动员和扩增DC细胞的关键生长因子，工程化的CAR-T细胞分泌Flt3L增加了骨髓和肿瘤中的DC前体细胞，增加了肿瘤内DC分泌IL-12和TNF，并抑制了肿瘤生长。关键的是，CAR-T细胞分泌Flt3L同时促进内源性CD8+T细胞肿瘤浸润，并导致表位扩散，表明使用Flt3L激活了宿主DC细胞，增强了淋巴细胞向实体瘤的迁移。

小结

CAR-T和CAR-NK细胞治疗是改善癌症患者预后的一种非常有前景的方法。虽然它们对血液系统恶性肿瘤很有效，但克服实体瘤依然困难重重。最近，人们将刺激迁移、改善肿瘤微环境和去除肿瘤屏障的药物与基于CAR-T/NK的治疗相结合，以改善CAR-T和NK细胞在实体瘤令人失望的表现。这些策略将为推进针对实体瘤的工程化T细胞和NK细胞治疗提供关键途径。

参考文献：

1.Controlling Cell Trafficking: Addressing Failures in CAR T and NK Cell Therapy of Solid Tumours. Cancers (Basel). 2022 Feb; 14(4): 978.