玻尿酸差异化：交联度和凝胶修饰度，傻傻分不清？

Hey guys，透明质酸填充剂注射是一种广泛使用的微创美容技术。尽管这些注射是相对低风险的手术，但它们可能会导致严重的不良血管和非血管并发症。在非血管并发症中，延迟性炎症反应是一个严重的问题，其特征是在填充剂注射后至少2周出现肿胀和硬结区域。然而，延迟炎症反应的病因和病理生理学尚未完全阐明。此外，文章之间的术语也存在差异，如“迟发性反应”、“迟发性炎症反应”、“迟发型超敏反应”、“迟发组织结节”、“非抗体介导的水肿”等。此外，各种研究表明，迟发性炎性反应由生物膜、结节和/或肉芽肿引起。然而，结节和肉芽肿可能代表延迟炎症反应的进行性现象，而不是病因。作者在先前研究的基础上讨论了延迟炎症反应的病因，包括回顾透明质酸填充剂本身的作用、患者的免疫状态、感染和注射技术。

透明质酸填充剂

透明质酸填充剂由高分子量（MW）透明质酸组成，使用诸如1，4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）的物质进行化学交联。市场上不同的产品，如非动物稳定的透明质酸（HA）、粘性聚密度基质（CPM）、弹性透明质酸、安全透明优化可靠制造和Vycross技术，都有不同的制造工艺。然而，这些过程通常涉及与BDDE的反应、洗涤和高压灭菌。尽管制造过程相似，但最终产品因交联时间、温度和透明质酸浓度的不同而有显著差异。因此，不同的产品可以在人体内诱导不同的组织反应，其中一些反应如下所述。

1,4-丁二醇二缩水甘油醚

如前所述，透明质酸填充剂由使用交联剂连接的透明质酸组成，修饰度描述了与交联剂分子结合的透明质酸酯二糖单体单元的百分比。然而，BDDE不能正确地交联两种透明质酸二糖，并且它们以完全反应的交联剂、侧链交联剂、失活的交联剂和残余交联剂的形式存在。失活型为BDDE，其具有非反应HA但水解形式，残留型为天然形式。FDA建议未反应BDDE的残留水平<2ppm的安全性。因此，与残留的BDDE类似，未反应的BDDE通常不会在最终的透明质酸产物中大量存在。失活的交联剂1,4-丁二醇二（丙-2,3-二醇）醚（BDPE）因其主要杂质而闻名。此外，在透明质酸填充剂中，悬垂型的比例远高于完全反应型。为了描述这些透明质酸填充剂的改性，先前的研究提出了可以表征与BDDE交联的透明质酸水凝胶的术语。

修饰度（MoD）是单（侧链型）和双键（完全反应型）BDPE残基与透明质酸二糖单元之和的化学计量比。与乙酰基相比，MoD百分比随着交联修饰的增加而增加。

交联剂比率指示与所有连接的交联剂相比的双键交联剂残基的分数，并且表示交联剂效率的量度。

交联度（CrD）是双键BDPE残基和透明质酸二糖单元的化学计量比。

根据先前的研究，CPM-2具有9.8%的MoD和1.06%的CrD，如图1所示。

图1：交联度示意图。总改性度为9.8%（示意性地为10%），交联度为1.06%（示意性的为1%）。BDPE，1,4-丁二醇二（丙-2,3-二醇）醚；CrD，交联度；CrR，交联剂比例；Mod，修改程度。

没有证据表明侧链BDDE和失活BDDE（BDPE）与延迟的炎症反应有关；然而，为了安全起见，理想的透明质酸填充剂产品的纯度应尽可能高。

透明质酸填充剂内部的杂质

作者之前的研究揭示了透明质酸填充剂产品中存在不纯颗粒。制造过程中，机械中通常会出现不锈钢。预充玻璃注射器的制造过程中可能会出现铝颗粒。铝可以诱导增强的体液免疫反应。在预充注射器中用作润滑剂的硅油也可以在透明质酸填充剂内被检测到并形成颗粒。23硅油可以作为佐剂，促进免疫耐受并诱导抗体反应。因此，硅油可以增强透明质酸填充剂引起的延迟炎症反应。根据美国药典26和欧洲药典27，对于≥10μm和≥25μm的颗粒，预充注射器中颗粒水平的阈值分别为每个容器6000和600。这意味着大于10μm的颗粒在1内不应超过6000 mL预充注射器。但是根据先前的研究，在1 mL HA填充剂产品中可以检测到更多的粒子。尽管没有直接证据表明透明质酸填充剂内的杂质会导致延迟的炎症反应，但透明质酸填充剂产品应尽可能纯净，不含大量杂质（表1）。

表1

透明质酸的分子量

高MW透明质酸的重量大于1000 kDa，并且已知其抑制炎症，因为CD44受体产生抗炎细胞因子。用于生产软组织填充剂的透明质酸的MW范围为500至6000 kDa。透明质酸的钠盐通常以二糖的形式出现，分子量约为401Da。透明质酸片段低于1000 kDa是促炎性的，并且可以通过激活Toll样受体2和4来启动炎症反应。一些研究表明，Vycross技术透明质酸填充剂由于其低分子量透明质酸成分，可能具有更高的延迟炎症反应风险。然而，尽管透明质酸填充剂通常含有高MW透明质酸，但它被透明质酸酶和活性氧降解为20kDa片段。因此，可以合理地假设植入的透明质酸填充剂的外围可以被透明质酸酶降解，并且透明质酸的低MW片段可以诱导炎症反应。然而，低分子量透明质酸诱导的炎症反应与感染和患者的免疫状态密切相关。此外，无论透明质酸交联如何，MW似乎对填充剂的炎症或免疫反应没有影响。需要进一步评估以确定MW对延迟炎症反应的影响。

制造工艺

除了BDDE、杂质和低分子量透明质酸之外，透明质酸填充剂产品中还可以存在各种物质。其中一种物质是生透明质酸。透明质酸填充剂通常来源于生透明质酸粉末，该粉末来源于细菌，但其纯度各不相同。可以使用不同的透明质酸填充剂来产生不同的纯度。此外，由于透明质酸是由发酵的链球菌产生的，因此透明质酸填充剂产品中可能存在一些内毒素。因此，透明质酸填充剂产品应进行纯化，使每个注射器的内毒素浓度小于20单位。在制造过程中，氢氧化钠用于在羟基链中形成醚键。因此，这种高碱性溶液应在洗涤过程中去除。没有证据表明杂质会引起延迟的炎症反应；然而，理想的透明质酸填充剂产品应尽可能纯净（图2）。

图2：可能存在透明质酸填充剂杂质。BDPE，1,4-丁二醇二（丙-2,3-二醇）醚；MW，分子量。

患者的免疫状况

透明质酸是人体组织的天然成分。即使透明质酸是用细菌生产的，就像大多数填充剂一样，透明质酸分子是相同的，与物种无关，植入体内时不会被识别为异物。在交联过程中，重要的是不要将透明质酸分子修饰到不再被识别为透明质酸的程度，因为这可能导致异物反应。异物反应是植入后炎症和伤口愈合的最后阶段。异物肉芽肿反应的目的是包裹和分离不能通过酶分解或吞噬作用立即清除的异物。然而，据报道，注射透明质酸填充剂后异物肉芽肿的发生率为0.02%-0.4%。39因此，注射后，异物反应的程度因透明质酸本身、患者的免疫状态和注射量等因素而异。

此外，结节和肉芽肿的发生不能用来预测哪些患者有风险。延迟炎症反应可在没有结节形成的情况下发生。因此，除了结节或肉芽肿的形成外，患者状态对延缓炎症反应也很重要。

流感样疾病患者往往会出现延迟性炎症反应。透明质酸注射和流感感染后T淋巴细胞引发的IV型超敏反应可能在迟发性结节中发挥作用。然而，最近的一篇文章报道，来自延迟炎症反应区域的活检中没有T细胞活性。有证据表明，病毒和细菌感染是免疫触发因素。最近的一项研究描述了病毒血症和免疫状态增强的疫苗接种后状态，以及在菌血症填充剂表面接种的毒力细菌，可能会诱导显著的免疫反应。另一项研究报告称，人类白细胞抗原亚型B*08和HLA亚型DRB1*03的患者发生延迟炎症反应的风险增加。

随着由严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2型（SARS-CoV-2）病毒引起的2019冠状病毒病（新冠肺炎）大流行的出现，全球范围内已有多种疫苗可用。新冠肺炎疫苗接种和新冠病毒感染后，透明质酸填充剂延迟炎症反应的报告有所增加。有人认为，新冠肺炎刺突蛋白作为延迟炎症反应形成的触发因素。刺突蛋白与血管紧张素转换酶受体的相互作用引起促炎辅助T细胞1反应并促进CD8 T细胞介导的反应。抗炎药或类固醇已被用于延迟炎症反应。然而，由于新冠肺炎疫苗与血管紧张素转化酶（ACE）2受体有关，因此已提出将赖诺普利等ACE抑制剂用于治疗延迟炎症反应。有案例已经使用了剂量5至10mg赖诺普利，肿胀在24小时内早期消退 在多个情况下为数小时。抗组胺药对延迟炎症反应的治疗无效。47因此，类固醇或10 mg赖诺普利似乎是治疗与新冠肺炎疫苗相关的延迟炎症反应的有前景的药物。

传染

任何植入的表面细菌的致病性都会影响患者的免疫反应，与真正的病原体相比，患者更有可能耐受和植入正常的皮肤共生细菌。因此，无菌和清洁操作应解决注射过程中的再污染问题。为了预防感染，重要的是要检查患者的感染史，以及以前的填充剂注射史。在填充剂注射程序之前完全去除患者的化妆品也是非常重要的。每根穿过皮肤的针头都有细菌污染的风险；然而，快速降解和吞噬作用可以解决入侵的细菌。葡萄糖酸氯己定和异丙醇是首选的防腐溶液。在微创美容手术（如填充剂注射）中，使用氯己定有助于降低感染发生率。因此，在透明质酸填充剂注射过程中，应使用防腐溶液维持无菌环境。

注射的团块

大量透明质酸填充剂与延迟炎症反应之间的关系存在争议。较大的注射团块会引起机械刺激并引发炎症反应。理想的填充剂应无毒、生物相容、可逆和安全。如前所述，即使透明质酸是使用细菌产生的，透明质酸分子也是相同的，与物种无关，并且在植入体内时不会被识别为异物。然而，由于透明质酸填充剂与交联剂交联，因此该填充剂可以被免疫系统识别为异物。一旦填充剂被识别为异物，就会发生吞噬作用；然而，这与填充剂的寿命有关。大于5μm的颗粒通常需要聚集的巨噬细胞（异物巨细胞）被吞噬，大于15至20μm的粒子通常不会被巨噬细胞吞噬或运输到局部淋巴结。身体的反应随着填充剂的成分而变化；透明质酸产生更多的淋巴细胞浸润，而钙羟基磷灰石产生更多的巨噬细胞。反应的强度取决于注射材料的免疫惰性。在1999年之前，透明质酸填充剂延迟炎症反应的报告率为0.7%。随着透明质酸产品纯度的提高，生产效率已降至约0.2%。

然而，如前所述，杂质仍然存在，即使是大剂量注射也会增加异物反应形成多核巨细胞的风险。当注射大量填充剂时，患者的免疫反应会延长更长的时间，这增加了生物膜形成的可能性。因此，大量的透明质酸填充剂具有引起异物反应和其他并发症的更大风险。 “组织整合”一词是指“生物组织内的分布模式，特别是填充材料与真皮纤维纠缠的方式。”尽管层和填充产品之间存在差异，但当透明质酸填充剂正确整合到组织中时，不会发生异物反应，或发生最小的细胞浸润。对人类的研究也表明，当皮内注射透明质酸填充剂0.2mL就可以引发异物反应。另一项研究表明，炎症反应的水平取决于透明质酸填充剂产品。因此，当适当地进行组织整合时，不会发生异物反应，并且当没有炎症迹象时，透明质酸填充剂在一年内缓慢降解。

结论

透明质酸填充剂引起的延迟炎症反应的病因尚不确定。然而，延迟的炎症反应与注射的透明质酸填充剂周围的异物反应和复发性炎症有关。因此，注入的填充剂应尽可能纯净，不含杂质。此外，透明质酸填充剂注射过程中应采用严格的无菌技术。

参考文献

1. Lee W, Shah-Desai S, Rho NK, Cho J. Etiology of Delayed Inflammatory Reaction Induced by Hyaluronic Acid Filler. Arch Plast Surg. 2024 Feb 7;51(1):20-26. doi: 10.1055/a-2184-6554. PMID: 38425859; PMCID: PMC10901605.