Nat Biotech：成功基因改造痤疮丙酸杆菌，有望用于青春痘的治疗

痤疮是一种常见的皮肤病，由毛囊皮脂腺阻塞或炎症引起。其表现形式各异，从粉刺和黑头到脓疱和结节不等，主要出现在脸部、额头、胸部、上背和肩部。虽然痤疮在青少年中最为常见，但它可以影响各个年龄段的人群。

痤疮最严重的病例通常采用抗生素治疗，以杀灭毛囊中的细菌，或使用异维A酸衍生物——维甲酸，它能诱导皮脂细胞死亡，这些是产生皮脂的表皮皮肤细胞。然而，这些治疗方法可能会导致严重的副作用，如破坏皮肤微生物组平衡、光敏感性，或者在维甲酸的情况下导致出生缺陷或皮肤极度脱屑。

2024年1月9日，庞培法布拉大学的Marc Güell等人，成功地编辑了痤疮丙酸杆菌（cutibacterium acnes）的基因组，使其分泌和产生NGAL蛋白，这种蛋白已被证明是痤疮药物异维A酸的介质，通过诱导皮脂细胞死亡来减少皮脂分泌。该研究成果以“Delivery of a sebum modulator by an engineered skin microbe in mice”为题，发表在Nature Biotechnology上。第一作者是庞培法布拉大学的Nastassia Knödlseder。

这项研究成功地利用基因工程技术改造了一种通常难以处理的皮肤细菌，使其能够产生治疗性分子，这为未来在治疗皮肤疾病和其他疾病时使用活体治疗提供了新的可能性和途径。

【痤疮丙酸杆菌转化和基因改造】

该过程涉及优化电转化协议、克服DNA进入细胞的障碍、提高基因敲除和基因插入的效率，以及研究目标蛋白NGAL（中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白）在皮肤油脂分泌中的潜在作用。

1. 电转化优化：首先，研究人员通过筛选不同的转化缓冲液组成和条件，改进了电转化协议，以提高DNA进入痤疮丙酸杆菌细胞的效率。研究使用荧光标记的寡核苷酸评估了DNA在细胞内的进入和稳定性，发现在含有272 mM蔗糖的缓冲液中DNA进入量约增加了50倍。研究还考察了DNA在细胞内的稳定性，推测部分荧光寡核苷酸可能会部分降解（图1a）。

2. 克服限制因素：研究表明，痤疮丙酸杆菌的DNA进入障碍可能由核酸外切酶和限制修饰系统引起。为了克服这些问题，研究人员创造了携带痤疮丙酸杆菌 IIIB 甲基化酶的 E. coli 亚型，以产生与痤疮丙酸杆菌相似的 DNA 甲基化模式，从而避免限制修饰系统的干扰，提高了DNA转化效率。结果显示，模拟宿主细菌的甲基化模式可以提高转化效率达200倍（图1b）。

3. 提高转化效率：除了甲基化系统的影响外，细菌细胞密度和转化DNA的量也对转化效率有影响。低量的DNA和较高的细胞密度对于转化效果更为有利。此外，通过冷冻和解冻过程，可以改善细胞膜完整性，有助于DNA内化。使用 L-甘氨酸和青霉素G作为细胞壁软化剂，以增加痤疮丙酸杆菌的转化效率。结果显示，L-甘氨酸预处理可将效率提高60倍，而青霉素G预处理（2-10 μg ml−1）可将转化效率提高1200倍（图1c）。

4. 基因敲除和插入：研究探索了基因敲入（KI）和敲除（KO）在痤疮丙酸杆菌中的应用，尤其使用了 minicircles（MCs）来提高转化效率。使用不带内源限制修饰系统的 MC 向量可以增加转化子的数量。同时，尝试了基因敲除 tdk 基因，创造了对氟尿嘧啶（FUDR）和红霉素双重选择的可能辅助营养缺陷株（图1d）。

5. NGAL蛋白的生产和分泌：通过使用内源蛋白质高度分泌的分泌信号，将NGAL-His基因与分泌信号融合，然后在痤疮丙酸杆菌中进行表达（图1e）。痤疮丙酸杆菌中产生的NGAL蛋白与外源表达的NGAL蛋白在数量上，除了 camp1 介导的分泌存在差异外，其他情况下，蛋白的表达量相近（图1f）。痤疮丙酸杆菌产生的NGAL蛋白的分子量，其与人体产生的NGAL蛋白相近，这表明痤疮丙酸杆菌产生的NGAL蛋白可能经历了类似的后转录修饰（图1g）。不同浓度的NGAL对痤疮丙酸杆菌的生长没有毒性影响，表明痤疮丙酸杆菌可用作NGAL的潜在运载体来通过其对人类皮脂腺细胞的介导作用减少皮脂产生（图1h）。痤疮丙酸杆菌产生的NGAL蛋白可以显著降低皮脂水平，类似于对照药物异维A酸（图1i）。

图1 | 痤疮丙酸杆菌电转化优化与NGAL表达。

【小鼠实验】

研究者将0.5%胨肽溶液（PBS控制组）、野生型痤疮丙酸杆菌（KPA171202）以及经过基因工程处理的痤疮丙酸杆菌（KPA171202表达NGAL蛋白（KI））局部涂抹于小鼠背部连续三天，并在三个时间点采集样品：第0天、第2天和第4/5天（图2a）。在经过基因工程处理的细菌处理的样本中，LCN2的表达量增加，而 WT 和胨肽处理的小鼠皮肤显示出有限的表达（图2b）。取自对照组、WT组和KI组小鼠的皮肤拭子样本，进行了质谱分析。与纯化的NGAL蛋白的参考光谱库进行比较后发现，只有来自KI组小鼠的皮肤拭子样本显示出多个参考肽段的存在（图2c）。

为了检测和识别生物检测样本中的痤疮丙酸杆菌，研究人员设计了一个专门针对痤疮丙酸杆菌的RNAscope探针。结果显示，在 WT 和 KI 处理的小鼠中，C. acnes定位于毛囊中，而在对照组中没有检测到C. acnes。C. acnes 被以红色的形式可视化为点状形状，而连续和大面积的染色代表了毛囊部分的非特异性染色（图2d）。

通过接合位PCR（扩增插入物的两个接合位）、V1-V3 16S rRNA测序和取样微生物培养来跟踪移植情况。结果表明，通过接合位PCR和培养，确认了经过基因工程处理的菌株的存在，同时通过16S rRNA测序发现 Cutibacterium sp. 已经在小鼠皮肤上移植成功（图2e）。WT 和 KI 样本的小鼠皮肤上，Cutibacterium sp. 的丰度在第0天很低，而在第2天和第4天几乎专门在 WT 和 KI 样本中找到。相比之下，对照样本的微生物组成更为多样化（图2e）。

这些结果说明了经过基因工程处理的痤疮丙酸杆菌成功移植到小鼠皮肤上，且在皮肤中产生了所需的蛋白，同时未观察到明显的炎症反应。

图2 | NGAL产生的痤疮丙酸杆菌菌株在小鼠皮肤上的植入。

【小结展望】

在这项研究中，展示了通过基因工程处理的皮肤共生菌C. acnes菌株在体内可控制地分泌治疗性分子NGAL，从而调节皮脂水平的证据。未来需要进行临床研究以评估这种经过基因工程处理的菌株对人体的影响，以及其在改善皮肤疾病或支持皮肤健康方面的潜在用途。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-023-02072-4

https://www.eurekalert.org/news-releases/1030497

来源：BioMed科技