王孝深教授组稿｜周鑫：EB病毒DNA在鼻咽癌中的应用现状、机遇与挑战

编者按：在华南和东南亚等地区，鼻咽癌的发生和流行与Epstein-Barr病毒（EBV）感染密切相关。一般认为，鼻咽癌大体肿瘤由EBV感染的单个肿瘤细胞增殖而成，EBV的复制和表达水平从一定程度上反应了体内肿瘤的负荷。因此，EBV相关指标一贯被视作重要的鼻咽癌生物标志物，广泛应用于鼻咽癌诊疗工作中。

本期「专家组稿」由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院王孝深教授担任执行主编，他将与复旦大学附属肿瘤医院周鑫博士在本期内容中分享EB病毒DNA在鼻咽癌中的应用现状、机遇与挑战，为医者和患者提供更多参考。

传统的EBV特异性抗体应用时间较长，但诊断特异性较差，半衰期较长，因此不能实时反映体内肿瘤活动。而近年来，血浆/血清游离EBV DNA的临床价值逐渐得到验证，并被公认为鼻咽癌诊断、评估与生存预后中最有价值的生物标志物之一。

一、游离EBV DNA的来源和应用基础

迄今为止，鼻咽癌中外周血游离EBV DNA的来源尚未完全阐明，多数观点认为可能的产生机制包括：（1）鼻咽癌细胞的凋亡；（2）治疗相关的肿瘤坏死；（3）原发肿瘤脱落的鼻咽癌活细胞及其克隆；（4）潜在感染的B淋巴细胞；（5）游离的EBV颗粒等。Chan等的测序结果显示，外周血游离EBV DNA为82-181 Kb的小片段DNA，其来源很可能是肿瘤细胞崩解后基因组DNA碎裂并释放入血。而另一项研究通过肿瘤抑制基因启动子甲基化对肿瘤源性EBV DNA片段比例进行了定量计算，发现肿瘤细胞坏死和凋亡是鼻咽癌相关EBV DNA的主要来源。也有研究认为，游离EBV DNA部分来自巨噬细胞对鼻咽癌肿瘤坏死和凋亡DNA产物的吞噬、消化和释放。此外，肿瘤活细胞及克隆也可能主动释放游离EBV DNA。据结直肠癌中提出的理论模型，当实体肿瘤增殖至超过100g，相当于3×1010个肿瘤细胞时，每天即会有3.3%的肿瘤DNA入血，类似现象可能同样存在于鼻咽癌中。值得一提的是，外周血游离EBV DNA的水平还受到治疗模式、入血途径等多种因素影响，呈现显著的个体差异和时间依赖性动态变化。

二、EBV DNA与鼻咽癌的诊断/筛查/评估

早在1996年，Lo YM等就发现鼻咽癌患者中EBV DNA阳性率高达96%，而正常对照组仅为7%，提示该指标对鼻咽癌的潜在诊断价值。此后，多项临床研究相继将其用于鼻咽癌诊断试验。截止目前，各中心EBV DNA检测多靶向EBV 基因组中高度稳定和保守的BamH1-W片段，其诊断敏感度从53%-99%不等（平均94%），而特异度达87%-100%（平均94%），相较于应用已逾30年的EBV相关抗体（VCA/IgA，EA/IgA），EBV DNA的诊断性能具有显著优势，并逐渐呈替代之势，成为鼻咽癌中最具前景的液体活检指标之一。

基于其优秀的诊断效能，EBV DNA逐渐被用于鼻咽癌的健康人群筛查，以冀实现鼻咽癌的早期诊断。在一项香港地区20174人的大规模筛查研究中，309人（1.5%）血浆EBV DNA呈持续阳性；在接受鼻咽镜、鼻咽MRI等检查后，34人最终被证实为鼻咽癌，其中大多为早期患者（71%），远超既往自然患者人群中的早期比例（20%-25%）。而广东四会和中山市开展的一项人群研究显示，基于EBV IgA筛查阳性结果之上进一步加做EBV DNA检测，其阳性预测值和阴性预测值分别可达30%和99.3%，提示EBV DNA和血清IgA具有潜在的协同筛查价值。值得一提的是，正常健康人体也可出现一过性EBV DNA升高，但在随访中很快转阴。相比之下，EBV DNA呈现持续阳性、甚至进行性升高的患者，应当高度怀疑存在EBV相关肿瘤风险，建议进一步重点排查鼻咽等。

除定性诊断外，游离EBV DNA定量结果还可用于定量评估鼻咽癌进展程度。早期研究显示，初治鼻咽癌患者血浆/血清EBV DNA浓度与肿瘤分期呈明显正相关，进展期鼻咽癌患者EBV DNA的中位水平可达早期患者的8倍。影像学定量分析则发现，无远处转移鼻咽癌患者的EBV DNA水平、肿瘤体积、18F-FDG PET-CT的SUVmax三者之间均具有显著相关性，强烈提示外周EBV DNA与肿瘤负荷有关。一项来自复旦大学附属肿瘤医院的研究结果则进一步提示，无远转鼻咽癌患者的血浆EBV DNA水平更大程度上决定于阳性淋巴结的体积，而原发灶对之影响较弱，其解剖和生物学机制尚有待进一步挖掘。

三、EBV DNA与鼻咽癌近期疗效评估

基于其肿瘤源性，血浆/血清游离EBV DNA的变化情况可灵敏反映治疗中肿瘤退缩情况，包括对诱导化疗、放疗的敏感性等。监测EBV DNA在各个静态治疗节点的检出情况、乃至密切追踪其动态变化，将有助于准确评估疗效，以便及时调整治疗策略。

静态检测节点涉及放疗后、系统性治疗疗程后、复发术后、一线治疗中多个时间点。在根治性放疗中，Lo YM等结合影像学评估，认为根治性放疗后EBV DNA跌落至阈值以下预示临床完全缓解，而持续EBV DNA阳性则提示肿瘤残留可能性大，可能需要追加放疗剂量。接受诱导化疗的局晚期鼻咽癌中，诱导后EBV DNA状态可有效反映放化疗敏感度，诱导后转阴者放疗后肿瘤完全退缩概率较高；此外，诱导后EBV DNA转阴者，后续同步化疗的强度对预后的影响减弱，提示诱导后EBV DNA阴性有望指导后续治疗，为后续减强度放化疗提供支持。放疗后颈淋巴结残留或复发、接受颈清扫术的鼻咽癌患者中，术后持续EBV DNA阳性提示手术清扫不全、肿瘤残留以及复发和转移危险，需考虑辅助治疗和密切随访。而在POLARIS-02研究中，化疗抵抗的复发转移鼻咽癌接受PD-1单抗治疗4周时EBV DNA衰减>50%者，其后续影像学客观缓解率显著更高，提示EBV DNA可早期反映免疫治疗疗效，以便后续药物调整。

动态监测EBV DNA清除速度亦具有重要意义。血液动力学研究发现，对根治性放疗敏感者，放疗开始后1周内均观察到一过性EBV DNA升高，峰值甚至可高达治疗前2.9倍，其成因可能与放疗所致坏死或凋亡瘤细胞释放大量核酸片段有关，一般认为是应答良好的标志。在此之后，由于体内吞噬和清除作用，EBV DNA水平快速衰减至较低水平。目前认为，治疗过程中EBV DNA清除越快，肿瘤完全缓解率和总生存率越高。相反，延迟清除乃至持续高水平通常提示高复发风险，例如，放疗中期（第4周）EBV DNA仍未转阴者，其治疗失败率显著上升。上述现象提示，血浆/血清EBV DNA的清除速度有望成为早期评估疗效的敏感指标之一，将为后期自适应放疗、更改系统治疗方案等精准治疗手段提供重要依据。

四、EBV DNA与鼻咽癌长期生存预后

（一）治疗前EBV DNA

治疗前基线EBV DNA水平与可预示鼻咽癌长期生存，尤其是远处转移。一项经典的台湾研究显示，以1500 copies/L为截断值，可以显著区分局部区域晚期鼻咽癌患者的DFS和OS，其预后作用独立于TNM分期。另一项香港研究也发现，治疗前EBV DNA 大于4000 copies/L者远处转移风险显著升高。基于其预后价值，基线EBV DNA水平有望在TNM分期基础上进一步细化风险分层。Leung等发现， I/II期鼻咽癌合并治疗前高水平EBV DNA者的死亡率逼近III期患者，而低水平EBV DNA者则和I期相当。在局部区域晚期（III-IV期）患者中，EBV DNA也可进一步筛选出预后更差的患者亚组。

鉴于基线EBV DNA水平的预后价值，NCCN头颈部肿瘤临床实践威廉亚洲博彩公司 从2010版开始正式将EBV DNA列为治疗前诊断和评估的推荐辅助手段，有望对UICC国际分期的不足作出补充。多项最新研究均显示，通过递归分割分析（Recursive partitioning analysis, RPA）将EBV DNA和TNM分期进行整合后，其衍生出的新分期系统的预测效能较单纯的TNM分期有了明显提高。但迄今为止，将EBV DNA与TNM分期系统整合仍然困难重重，其中最大难点就在于各中心EBV DNA检测结果差异极大，采用的预后界值也各不相同，很难得出统一结论。多中心之间EBV DNA检测方法的标准化、结果互认仍有待改进，以期未来更好地将EBV DNA应用于临床。

（二）治疗后EBV DNA浓度与预后

多项研究表示，治疗后DNA的预后效能要优于治疗前水平，其对预后的区分度明显大于治疗前DNA。越来越多证据表明，治疗后EBV DNA状态和治疗前EBV DNA在鼻咽癌中代表着不同的临床价值。治疗前EBV DNA水平体现了肿瘤的基线负荷，而治疗后EBV DNA持续阳性则可能提示肿瘤残留，高敏感性的检测手段更是使得“微小残留灶”（minimal residual disease）的发现成为可能。因此，一些学者提出，鼻咽癌接受根治性放疗后，即使影像学上完全缓解，EBV DNA阳性的患者仍具有较高复发和转移风险，可考虑酌情予以辅助化疗。

五、EBV DNA与鼻咽癌治疗后随访监测

以往的鼻咽癌常规随访监测往往依赖于影像学检查，血液学指标缺乏。EBV相关抗体如VCA/IgA等在反映肿瘤活动上往往存在滞后性，例如，肿瘤达根治后，VCA/IgA还将在相当长时间内持续阳性。相比之下，血浆/血清EBV DNA可以实时、动态反映体内肿瘤活动情况，用于随访监测也更为敏感。研究证实，治疗后随访过程中，EBV DNA升高可以比临床症状和影像学检查提早6个月发现复发转移。Ngan等则对鼻咽癌患者根治性放化疗后进行连续血清EBNA-1 EBV DNA监测，结果发现，62%患者在临床复发之前即出现DNA升高（平均提前时间17.4周），38%则与复发同时出现。多项研究提示，将血浆EBV DNA作为筛查手段，辅以18F-FDG PET-CT，有助于进一步提高复发、转移的准确度，且节省了大笔费用。

六、EBV DNA研究新动向

（一）放疗后EBV DNA阳性者是否需要辅助化疗

一项回顾性研究显示，根治性放疗后EBV DNA仍呈阳性的鼻咽癌患者约占13.4%，其中部分人接受口服和/或静脉辅助化疗后，远处转移率和死亡率较无辅助化疗组显著降低。然而，HKNPCSG-0502研究将治疗后EBV DNA阳性患者随机分组至辅助化疗组和观察随访组，却发现二组OS、局部复发率和远处转移率均无显著差异，提示并非所有治疗后EBV DNA阳性者均能从辅助化疗获益。Hui EP通过结合TNM分期和治疗后EBV DNA，进一步将0502辅助组分为3个预后亚组，并认为其中低风险组长期预后较好，可豁免辅助化疗。随着亚组分析和联合分析的细化，对治疗后EBV DNA的预后及治疗指导价值的认识还有待进一步深化。

（二）复查随访中EBV DNA能否精准预测复发转移

一项回顾性研究对1984例初治无转移鼻咽癌患者进行治疗后监测，其中767在随访中出现EBV DNA阳性，其复发率远大于阴性者（63.8% vs 8.6%）；血浆EBV DNA能有效预测局部（准确度78.2%）、区域（85.9%）和远处转移（92.8%），其中对于远处转移的预示尤为突出。值得一提的是，随访中EBV DNA阳性相较于临床影像学复发转移平均提前2.3月，为临床早期干预提供了宝贵时间窗。在此基础上，另一项研究通过倾向配比评分探索了随访中EBV DNA阳性者提前采用口服化疗干预的有效性，结果提示，相较于传统密切观察随访的处理，提前口服化疗可使EBV DNA阳性患者全组和各亚组的DFS显著提高，提示EBV DNA这一生物标志物对于随访复查中治疗选择的重要参考价值。

（三）诱导化疗期间EBV DNA早期清零能否指导后续减强度放疗

Lv JW等发现，鼻咽癌诱导化疗过程中，不同的EBV DNA缓解类型（早期、中期、晚期缓解、治疗抵抗）对应不同治疗敏感性和复发风险，并进而提出，诱导1周期后EBV DNA即清零的患者，后续可考虑省略同步化疗等减强度治疗；而诱导2周期后仍持续阳性者，可能具有原发化疗抵抗，后续可能需要考虑更换化疗方案或引入靶向药物等，必要时需排查治疗中远处转移可能性。相应的前瞻性临床研究正在进行中，其结果值得期待。

七、EBV DNA的局限和挑战

EBV DNA在鼻咽癌中的应用面很广，却并非万能。在鼻咽癌非流行区域，多数角化性鼻咽癌（WHO I型）以及部分非角化性癌与EBV并无关联，EBV DNA的价值较为局限。其次，受肿瘤负荷和入血途径的限制， I期鼻咽癌EBV DNA阳性率仍然较低，仅50%-86%。此外，手术、放疗等对肿瘤周围血管造成的不可逆损伤可能导致EBV DNA入血障碍，敏感度极大下降。如何提高这部分患者的DNA检出率，以及如何联用其他指标提高诊断准确性，仍是亟需解决的问题之一。

总结和展望

血浆游离EBV DNA定量检测方便、快捷、创伤小、费用低，是具有良好敏感度和特异度的新型鼻咽癌肿瘤标志物。其在鼻咽癌诊疗中临床价值已得到众多数据验证。然而，目前的检测方法学仍存在异质性，中心之间结果互认存在障碍。将来应进一步鼓励各中心的数据交流，鼓励研究检测标准化流程，以推广EBV DNA检测结果的普适性。

此外，外周游离EBV DNA的生物学角色仍未完全阐明，其在体内产生、分布、清除的过程尚需要基础研究论证。同时，EBV DNA体现出的某些特性，如其浓度受转移淋巴结、远处转移影响更明显，其背后的生物学机制及临床应用，将值得进一步研究解答。